Avaliação da dinâmica imunologicamente relevantes Terciário características estruturais do HIV 1-V3 loop Sequence R2 Crown por Ab initio Folding

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar as preferências estruturais dinâmicas da sequência do peptídeo da coroa V3 da cepa R2 do HIV por meio do dobramento AR, e correlacionar os resultados com as sensibilidades conhecidas à neutralização da cepa R2. Isso é alcançado pela seleção de um fragmento apropriado da coroa do laço V3 da R2 para dobramento AR bonni. Como segundo passo, realiza-se a simulação do dobramento, que busca todas as possíveis conformações do fragmento da coroa R2 e registra as conformações mais prováveis em um arquivo de pilha.

Em seguida, as conformações registradas são analisadas para determinar a preferência estrutural dinâmica da coroa R dois V três que possa explicar sua sensibilidade à neutralização. São obtidos resultados que indicam uma preferência por uma fita beta rígida nas posições 12 a 14 do loop V três com base na estrutura secundária, preferência e distribuição de energia do conjunto de conformações pesquisadas. Olá, sou Timothy Cardozo, falando diretamente do meu laboratório no Departamento de Farmacologia da Escola de Medicina da Universidade de Nova York.

Hoje vamos mostrar um procedimento para o dobramento ab initio de um loop flexível em uma proteína viral imunogênica do HIV-1 conhecida como GP120. O loop flexível é conhecido como o loop V3 da glicoproteína do envelope superficial do vírus HIV-1, e sua extremidade é conhecida como a coroa do loop V3. Esta é a região que iremos dobrar.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para nos ajudar a identificar vias produtivas rumo ao desenvolvimento bem-sucedido de vacinas contra o HIV. Então, vamos começar. Para iniciar este procedimento, selecione a sequência do trímero do domínio V3 para ser dobrada in silico.

Estudos anteriores deste laboratório indicam que as posições 10 a 22 de qualquer sequência do loop V três fornecem os melhores resultados. Execute os experimentos de dobramento de armenio utilizando os menus suspensos fáceis de usar na interface gráfica do usuário ou GUI do software de modelagem molecular ICM Pro. Primeiro, a estrutura atômica tridimensional do peptídeo correspondente a esta sequência deve ser construída no espaço virtual do computador. Para construir a estrutura atômica tridimensional, vá até o menu arquivo e selecione novo.

Isso exibirá uma tela com várias guias. Selecione a guia do peptídeo e cole ou digite a sequência na caixa de texto. Clique em OK para gerar a estrutura tridimensional do peptídeo.

A estrutura aparecerá na janela gráfica do ICM. Uma vez que a estrutura tridimensional tenha sido construída, vá ao menu de mecânica molecular e selecione minimizar, o que abrirá um menu lateral. No menu lateral, escolha global.

Isso exibirá uma tela com diversos campos de entrada e caixas de seleção já selecionados com os parâmetros padrão. Se necessário, altere a seleção para escolher o peptídeo a ser dobrado. Ajuste o comprimento e a precisão da simulação alterando, respectivamente, o número de movimentos globais e o número de chamadas de mínimos locais.

Selecione tudo para a dobragem de todos os átomos do peptídeo. Em seguida, selecione salvar filme para criar um arquivo de vídeo da dobragem. Por fim, clique em aplicar para iniciar a dobragem na janela gráfica.

O algoritmo começa a dobrar o peptídeo em diferentes conformações, calculando e registrando a energia do peptídeo para cada conformação. Após concluído, a conformação do peptídeo mais energeticamente estável, bem como conformações alternativas com energia quase idêntica, serão identificadas e visualizadas no computador realizando o dobramento do peptídeo. Usar a interface gráfica demonstra como é o processo de dobramento, mas não permite a seleção ideal de parâmetros para o dobramento da alça V três da coroa.

Para esse fim, é preferível realizar a dobragem a partir da linha de comando não gráfica utilizando um script. Um script é simplesmente uma série de comandos em texto salvos linha por linha em um documento ou arquivo de texto, que são inseridos automaticamente no programa ICM e executados um após o outro para dobrar o loop V três utilizando um script de linhas de comando. Primeiro, crie um arquivo de texto para ser salvo no disco rígido do computador em um diretório local. Como antes, comece construindo o peptídeo no espaço virtual do computador.

Em seguida, atribua um nome à simulação e defina o número de variáveis livres, que são as ligações químicas no peptídeo deixadas livres para girar durante a dobragem. Depois, especifique por quanto tempo a simulação será executada para a dobragem ideal do loop V três. Isso dependerá do número de variáveis livres identificadas na etapa anterior para determinar a precisão da busca conformacional no experimento; defina o número de etapas de busca a serem realizadas em cada mínimo local.

Em seguida, defina outros parâmetros que foram otimizados para a simulação com base em pesquisas anteriores, incluindo a minimização de temperatura, gradiente e distribuição de probabilidade. Após a definição dos parâmetros experimentais, indique quais cálculos de energia serão utilizados durante a dobragem. Aqui, a energia de Vander Vi é indicada por VW internal peptide.

A energia é indicada por 14 ligações de hidrogênio; a energia é indicada por HB eletrostática. A energia é indicada por El Salvation. A energia é denotada por SF e a entropia é denotada por EN. Especifique as configurações finais, incluindo os ângulos preferidos da cadeia principal e da cadeia lateral a serem pesquisados e a confirmação inicial.

Por fim, escreva o comando para executar e salvar o cálculo. Depois que o script tiver sido escrito e salvo como um arquivo de texto, execute-o a partir do prompt de comando do sistema operacional do computador. Como antes, a confirmação mais energeticamente estável do peptídeo, bem como confirmações alternativas com energia comparável, serão identificadas e salvas no arquivo do projeto para visualização no computador.

Após a conclusão do cálculo, abra o arquivo selecionando "abrir arquivo" no menu suspenso do EE. Exiba a molécula clicando na caixa de seleção ao lado dela no painel de trabalho e selecione a visualização em pilha de mecânica molecular. Para visualizar a pilha classificada por energia das principais conformações do peptídeo resultantes da dobragem, clique na ferramenta de plotagem no canto inferior direito do painel de pilha para gerar o gráfico dos resultados.

Primeiro, clique em OK na janela resultante e, em seguida, clique na guia central do gráfico chamada melhor conf. Depois, clique na primeira linha da tabela de resultados, que é a confirmação de energia mais baixa encontrada na busca. A estrutura do peptídeo se reorganizará em sua confirmação de energia mais baixa na janela gráfica.

Analise esta conformação quanto a características semelhantes a lâminas beta ou hélices alfa, especialmente nas cinco primeiras posições do peptídeo. Selecionando esta região na sequência e clicando no ícone de bastão no canto superior esquerdo da tela para exibir todos os átomos. Em seguida, a pilha de resultados de energia deve ser analisada para traçar as melhores conformações.

Se a conformação de menor energia estiver separada por uma lacuna significativa das demais conformações, isso indica uma tendência em direção a uma estrutura rígida. Para avaliar os resultados, abra o frasco do projeto e escolha a visualização em pilha de mecânica molecular; uma tabela das conformações em pilha será exibida. Visualize as conformações em pilha clicando no ícone do histograma.

Por fim, clique em reproduzir pilha de mecânica molecular para criar um filme na pilha e visualizar as preferências conformacionais reveladas pelo dobramento aqui. Os resultados para o dobramento R dois são mostrados. A conformação não é helicoidal alfa e corresponde a uma bobina aleatória, como esperado para coroas de alça V três, notavelmente no fragmento do resíduo 12 ao 14.

No loop V três, observa-se ao longo da pilha uma clara preferência conformacional por fita beta, sendo observadas muito poucas conformações alfa helicoidais. Uma conformação local em fita beta é reconhecida pela sua forma linear estendida. Esta é a localização da sequência incomum de isoleucina-prolina-metionina da cepa R dois, uma sequência rara em cepas de HIV nesta posição, e que tem sido hipotetizada como responsável pelas características incomuns da R dois.

Além disso, observa-se uma lacuna de energia de quase três unidades entre a confirmação de energia mais baixa e a segunda confirmação de energia mais baixa. Assim, a estrutura abandona brevemente a confirmação de energia mais baixa menos de 1% do tempo, sugerindo que a coroa R dois V três e sua confirmação local de tensão beta nas posições 12 a 14 apresentam uma estrutura mais rígida, ao invés de serem completamente flexíveis por natureza. Acabamos de mostrar como dobrar uma sequência de coroa em alça V três utilizando o algoritmo abio implementado no software ICM, e mostramos como analisar os resultados utilizando a tensão R dois do vírus HIV.

Como exemplo, ao realizar este procedimento, é importante escolher cuidadosamente a identidade do peptídeo dobrador correspondente a um fragmento da coroa V três, e também é fundamental interpretar os resultados com relação à preferência conformacional e energia, com consultoria especializada de um modelador molecular. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.