Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

O objetivo geral deste procedimento é permitir a configuração rápida e confiável, de forma automatizada, de matrizes baseadas em QPCR. Isso é realizado primeiramente preparando os conjuntos de iniciadores para a matriz e preparando as misturas mestras de amostras a serem analisadas. Em seguida, utiliza-se um sistema automatizado robótico de preparação de PCR ou um sistema de pipetagem eletrônica em matriz para transferir com precisão a mistura mestra de amostras e os conjuntos de iniciadores para cada poço de uma placa de 384 poços.

Uma vez preparadas, as reações de PCR em placas de 384 poços são executadas com o programa de PCR baseado no Light Cycler Four 80 Cyber. A etapa final do procedimento é analisar os dados de qPCR e determinar os níveis de expressão relativos para cada par de primers testado, cada um dos quais direciona um mRNA específico. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram alterações na expressão de grandes conjuntos de mRNAs.

Matrizes desenvolvidas especificamente podem, portanto, direcionar-se a perfis completos de microRNAs prévios, vias específicas ou moléculas-chave para infecção viral por meio de perfilagem baseada em QPCR. Olá, sou Dirk DMA do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. Hoje vamos mostrar como montar uma QQPCr em tempo real e apresentaremos dois métodos.

Um, utilizando pipeta irregular, e outro utilizando um robô. Utilizamos esta tecnologia para medir pré-microRNAs e microRNAs maduros em tumores humanos. A demonstração de hoje será realizada por Pauline Chu e Kristen bu.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, retire as placas de iniciadores contendo 186 pares de iniciadores em formato de 96 poços a 0,5 picoMoles armazenadas a menos 20 graus Celsius.

Após descongelar as placas em temperatura ambiente, agite-as em vórtex e centrifugue-as brevemente. Também descongele duas vezes a mistura PCR com cyber green em temperatura ambiente. Para a preparação de cada placa de 96 poços com primers, serão necessários quatro tubos de mistura mestra. Prepare a mistura mestra combinando quatro microlitros da mistura com cyber green, três microlitros de água livre de nucleases para PCR e 10 a 20 nanogramas de DNA ou cDNA da amostra por reação em cada um dos quatro tubos einor de dois mililitros.

Cada tubo deve conter quantidade suficiente de mistura mestra para aproximadamente 100 reações, permitindo excesso para perdas durante a pipetagem. Vortexar os tubos einor para homogeneizar. Iniciar a preparação do ensaio de microRNA precursor utilizando o robô Tecan EVO com a inicialização do robô e carregamento do programa EVO wear.

Em seguida, lave o robô três vezes com 30 mililitros de líquido do sistema para eliminar bolhas de ar que possam interferir na precisão da pipetagem. Depois, prepare a plataforma do robô incluindo uma placa de 384 poços e uma placa de primers de 96 poços. As misturas mestras em um reservatório contendo 2% de hipoclorito, um recipiente de fluido cheio do sistema e um recipiente de resíduos vazio.

Inicie a execução automatizada do robô selecionando "executar" duas vezes ao final do programa. Remova a placa de 384 poços e sela-a com folha de alumínio Light Cycler Four 80 Ceiling. Em seguida, centrifugue a placa.

Coloque brevemente a placa selada de 384 poços na posição um do hotel. Em seguida, repita este processo para a placa de iniciadores dois com novas misturas mestras e uma nova placa de 384 poços. Coloque a placa de 384 poços selada resultante na posição dois do hotel.

Abra um novo programa de uso do EVO para carregar o ciclo térmico a partir do hotel e defina os parâmetros de ciclagem. Em seguida, selecione executar duas vezes. O Freedom Evo carregará automaticamente cada placa no ciclo térmico e executará o programa de ciclagem HRM com cyber green.

Uma vez concluído, revise e analise os resultados conforme descrito no protocolo escrito como alternativa ao uso do robô. Uma pipeta eletrônica multicanal em matriz pode ser usada para começar a colocar o conteúdo do tubo de mistura mestra em um reservatório.

Configure a pipeta eletrônica para aspirar 16 microlitros de mistura mestra com dois passos de dispensação de oito microlitros seguidos por um passo de purga. Após configurar a pipeta, aspire 16 microlitros de mistura mestra e comece a dispensar em uma placa de roda de 384 poços. Dispense os primeiros oito microlitros em todas as outras linhas da coluna um, utilizando as linhas de A a O, deixando a próxima coluna vazia.

Dispense os segundos oito microlitros nas mesmas linhas da coluna três. Em seguida, purgue sobre um recipiente de resíduos e descarte as ponteiras seguindo este padrão de deixar linhas alternadas e colunas alternadas. Dispense ao longo da placa por mais cinco ciclos para pipetar a mistura mestra dois.

Utilize as mesmas linhas do mix mestre um, mas inicie na coluna dois. Repita este procedimento para os mixs mestres três e quatro, iniciando nas colunas um e dois, respectivamente, mas desta vez utilizando a rosa B para P.Her da placa de iniciadores. Configure uma pipeta eletrônica para aspirar dois microlitros e dispensar dois microlitros, seguido de um passo de purga.

Transfira dois microlitros de iniciadores da coluna um, linha A a H de uma placa de 96 poços para iniciadores para cada coluna ímpar da placa de 384 poços, descartando o líquido em um recipiente de resíduos e descartando as ponteiras. Repita esse padrão para o quatro iniciadores com as três misturas mestras restantes das colunas um e dois. Em seguida, continue esse processo para as colunas dois a 12 da placa de 96 poços, avançando a cada duas colunas na placa de 384 poços para cada coluna de iniciadores.

Em seguida, feche as placas com uma tampa de ciclador térmico, papel alumínio e centrifugue. Imediatamente após a centrifugação, coloque as placas em um ciclador térmico LightCycler 480 e realize os ciclos utilizando o formato de detecção HRM com SYBR Green I.

Usando as mesmas condições de ciclagem anteriores, repita este procedimento utilizando a placa de iniciadores dois Eloqua em uma nova placa de 384 poços, com misturas-mestras recém-preparadas. Assinaturas de micro RNA precursor emergem por meio do perfilamento utilizando uma matriz baseada em QPCR inovadora. O delta CT médio, normalizado em relação ao U seis, foi calculado e os valores padronizados foram carregados na matriz.

Softwares menores gerando três agrupamentos distintos exibidos como mapas de calor. A expressão relativa de cada microRNA precursor é mostrada, com vermelho e azul representando aumento e diminuição na expressão relativa, respectivamente. A intensidade da cor indica o grau de alteração na expressão.

A maioria das microRNAs precursoras sofreu pequenas alterações insignificantes, conforme esperado. No entanto, uma pequena fração das microRNAs precursoras aumentou significativamente ao longo do experimento com curso temporal. Além disso, o nível relativo de algumas microRNAs precursoras diminuiu drasticamente.

Em alguns casos, eles também se agrupam juntos na análise de mapa de calor. Dependendo do experimento, podem surgir agrupamentos que dependem da infecção viral, da expressão específica do tipo celular de microRNAs precursores ou de microRNAs precursores que são regulados por uma molécula comum ou por uma via de sinalização.

Os ciclos médios de limiar ou cts de uma amostra negativa para o vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi, analisada em quadruplicata, são mostrados. Importante, o antígeno nuclear associado à latência do vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi, ou KSHV Lana, não foi detectado nesta amostra pelo array de QPCR altamente sensível. No entanto, tanto o controle interno U seis quanto o let sete a, um microRNA humano precursor altamente expresso, foram expressos em níveis detectáveis.

Finalmente, como esperado, o controle negativo com água grau PCR não gerou produto de A-Q-P-C-R. Uma análise de curva de dissociação para dois primers diferentes é mostrada, utilizando o mesmo duplicado de amostragem.

É evidente que a temperatura de desnaturação é diferente para os dois pares de primers, mas a amostra está se desnaturando exatamente na mesma temperatura em cada replicata. Sinais de uma amostra ruim ou potencialmente contaminada podem incluir vários picos de desnaturação, sugerindo a presença de duas fontes diferentes de material de entrada. Acabamos de mostrar como configurar experimentos de QPCR em tempo real usando um robô.

É importante que você inclua todos os controles e o maior número possível de genes de referência. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.