Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

O objetivo geral deste procedimento é acoplar a coleta de produtos frescos baseada em fita adesiva à detecção molecular de células inteiras de espécies de Salmonella por meio da hibridização fluorescente rápida em C dois, também conhecida como fish. Isso é realizado primeiramente aplicando-se fita adesiva ao material desejado e extraindo as células ligadas à superfície. As fitas com células aderidas podem ser analisadas diretamente ou submetidas a enriquecimentos em fase sólida ou líquida.

O segundo passo do procedimento é feito em fita, com fixação e desidratação em uma série de etanol para células aludidas ou enriquecidas em caldo. O segundo passo envolve a fixação das células em suspensão, seguida pela suspensão das células em Resus tampão de armazenamento. O terceiro passo do procedimento é realizar uma etapa rápida de hibridização em fita utilizando um coquetel de sondas oligonucleotídicas específicas para salmonela, seguida pela remoção do excesso de sonda com uma lavagem com tampão para amostras analisadas por fax; a etapa de fish é realizada em suspensão, e o excesso de sonda pode ser removido usando uma simples etapa de diluição antes da análise.

O passo final do procedimento é contracorar as células aderidas à fita hibridizada com DPI e examiná-las utilizando microscopia de fluorescência. Para análises baseadas em fatos, uma contracoloração não é necessária. Em última análise, este método fornece um meio para detecção visual ou citométrica de espécies de *Salmonella* que possam estar presentes em produtos frescos amostrados.

Tive pela primeira vez a ideia para este método ao ler sobre um grupo italiano que estava usando uma abordagem semelhante para examinar comunidades bacterianas em relíquias de pedra aero romanas. Mas r e eu conduzimos uma discussão sobre este trabalho em uma aula que eu ministrava sobre métodos rápidos em microbiologia de alimentos. Algumas semanas depois, um surto de salmonela associado a produtos frescos começou, deixando quase 1500 pessoas doentes em 43 estados diferentes.

Embora nossa abordagem experimental ofereça uma via oportuna e prática para a detecção de tipos bacterianos específicos em produtos frescos, ela também é suficientemente portátil para permitir testes no campo ou em um ambiente de produção de alimentos. Comece selecionando uma fita para uso na coleta de amostras. Algumas opções incluem a fita comercialmente disponível para fungos ou contato, que são estéreis e também embaladas para facilitar o uso.

Com uma caneta permanente, desenhe quadrados de um centímetro no lado não adesivo de uma fita adesiva de 10 centímetros usando um molde estéril de alumínio. Isso servirá como guia visual para indicar qual parte da fita foi usada para coletar a amostra da superfície alimentar ou ambiental, formando um laço em formato de C com o lado adesivo voltado para a superfície a ser amostrada. Para isso, segure as extremidades adesivas com o polegar e o dedo médio e posicione o indicador contra o quadrado desenhado no verso da fita.

Coloque a fita na superfície a ser amostrada e pressione suavemente a área marcada contra a superfície sem soltar as bordas da fita. Use o dedo indicador para garantir que o lado adesivo da fita entre em contato completo com a superfície da amostra. Evite bolhas utilizando um movimento uniforme.

Puxe lentamente a fita da amostra. Para extrair fisicamente microrganismos aderidos à superfície, fixe a carga celular. Coloque a fita com o lado adesivo voltado para cima sobre uma lâmina de microscópio de vidro. Usando uma fita transparente comum de escritório, assegure-se da tensão e do alongamento adequados da fita, de modo que seja criada uma superfície plana e sem rugas.

Isso ajudará a minimizar problemas de deformação ou encurvamento da fita durante o aquecimento subsequente. Durante a hibridização, coloque a fita com a face voltada para baixo sobre o quartil de corte de xilose ou placas XLT quatro agri, de modo que as células amostradas fiquem em contato direto com a superfície agri para facilitar a remoção da fita da superfície agri.

Após o enriquecimento, a porção da fita com a amostra sobrejacente é colocada em contato direto com a superfície do ágar, e uma das extremidades da fita é aderida levemente. As placas de Petri são invertidas para evitar condensação e incubadas a 35 graus Celsius. Para permitir crescimento suficiente de espécies de Salmonella, o tempo de incubação necessário para enriquecer as células até um nível detectável dependerá dos níveis iniciais de contaminação por Salmonella.

Após o período de enriquecimento desejado, abra a placa de ágar; a fita manterá sua aderência durante a incubação. Pressione suavemente a fita contra o ágar usando o dedo indicador para garantir a recuperação máxima das microcolônias formadas na interface entre a fita e o ágar. Segure a fita pela borda presa à parede da placa de Petri e remova-a com um movimento lento e uniforme. Usando uma fita transparente comum de escritório, monte a fita com as células aderidas com o lado adesivo voltado para cima sobre uma lâmina de microscópio, de modo a criar uma superfície plana e sem rugas.

Realize a fixação celular em lâmina por 30 minutos a 25 graus Celsius, cobrindo a área de contato da amostra com 500 microlitros de formalina tamponada neutra a 10%. Descarte o fixador em um recipiente vedável sob capela química para minimizar a exposição a vapores irritantes ou tóxicos. Lave a lâmina uma vez com solução salina tamponada com fosfato 1x ou PBS, inundando suavemente a superfície da lâmina com PBS para desidratar a amostra. Utilizando uma série progressiva de etanol, prepare os tampões de pré-hibridização, hibridização e lavagem com soluções comerciais de grau biologia molecular, filtrando com uma seringa de 0,22 micrômetro e aquecendo previamente os tampões de hibridização e lavagem a 55 graus Celsius.

Adicione sondas de oligonucleotídeos marcadas com fluoróforo ao tampão de hibridização pré-aquecido para obter uma concentração final de sonda de cinco nanogramas por microlitro. Cubra a área de contato da amostra com o modelo na fita com 300 microlitros do tampão de hibridização contendo a mistura de sondas e hibridize as células aderidas à fita em uma câmara de incubação úmida e vedada ajustada a 55 graus Celsius; para um incubador com contato direto, como o instrumento no modo lâmina, hibridize por 15 minutos. Após a hibridização, remova as lâminas e descarte a camada do tampão de hibridização contendo a sonda. Enxágue brevemente e suavemente com tampão de lavagem pré-aquecido utilizando pipeta.

Um pequeno volume de tampão sobre uma lâmina inclinada permite que as lâminas sequem ao ar para a detecção de espécies de Salmonella por microscopia de fluorescência. Cubra a lâmina com cerca de 10 microlitros de Vector Shield H 1200, meio de montagem contendo DAPI, o corante nuclear contraste, e incube no escuro por 10 minutos. Coloque óleo de imersão sobre a lamínula e examine as amostras utilizando um objetivo de imersão de alta magnificação.

O filtro DPI é utilizado para colocar a amostra em foco. Em seguida, o microscópio é comutado para o filtro apropriado, e as células de salmonela são contadas visualmente de acordo com sua fluorescência verde ou vermelha, dependendo da corante usado para marcar as sondas. Para detecção por citometria, transfira as amostras suspensas em PBS para tubos de coleta cónicos de cinco mililitros e examine utilizando um citômetro de fluxo com excitação em 647 nanômetros.

Analise os dados utilizando o software FlowJo. A amostragem com fita adesiva de *Terica* sorovar, *Ty murium*, da superfície de um tomate artificialmente contaminado, facilita a análise pós-ictiológica direta por meio de microscopia ou citometria de fluxo de carga celular. As fitas foram processadas para hibridização rápida com fluorescência em C dois, utilizando uma combinação de sondas de DNA específicas para *Salmonella* marcadas com Texas Red, dependendo da concentração local inicial de células de *Salmonella* na fita.

O enriquecimento em fase sólida gerou resultados que variaram de microcolônias isoladas até crescimento confluente. As células coletadas com fita adesiva puderam ser analisadas por meio de hibridização in situ com fluorescência combinada à citometria de fluxo, imediatamente após a coleta ou após cinco horas de enriquecimento em superfície líquida a 35 graus Celsius.

Embora tenhamos descrito o uso da técnica de fita adesiva para a segurança alimentar, o método também possui bom potencial para aplicação em outras disciplinas, incluindo microbiologia ambiental, patologia vegetal ou microbiologia clínica. Paralelamente a este procedimento, experimentos adicionais, como testes bioquímicos ou PCR, podem ser realizados em enriquecimentos em fase sólida ou líquida provenientes de amostras extraídas com fita. Os testes podem ser utilizados para responder perguntas sobre uma salmonela que possa estar presente, questões que estão além do escopo do procedimento de fita adesiva.