Western Blotting: Preparação de amostras para detecção
14 de outubro de 2010
Western blotting é uma técnica analítica usada para detectar proteínas específicas em uma dada amostra de homogeneizado de tecido ou extrato.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a facilidade de realizar um Western blot ao utilizar produtos apropriados. Após a preparação da amostra, as proteínas são separadas com base no tamanho e, em seguida, transferidas para uma fase sólida. As proteínas são então detectadas com anticorpos, e o uso de protocolos adequados e reagentes de alta qualidade e custo-efetivos produz resultados aprimorados em Western blot.
Olá, sou Jesse Luhan, cientista de P&D da EMD Chemicals em San Diego, Califórnia. A EMD é uma afiliada da Merck KGaA em Darmstadt, Alemanha. Hoje vamos mostrar a você um procedimento de western blotting.
Então vamos começar. O primeiro passo no western blot é a preparação da amostra. Inicie a preparação da amostra pelizando as células usando centrifugação de baixa velocidade, como cinco minutos a 2.500 ×g.
Após a centrifugação, remova os pellets celulares. Resuspenda bem as células no reagente de extração de proteínas cyto buster utilizando 150 microlitros por 10 elevado a seis células. Incube a amostra à temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, centrifugue a amostra por cinco minutos a 16.000 ×g a quatro graus Celsius após a centrifugação. Transfira o sobrenadante claro para um tubo novo e prossiga com a análise. Após a avaliação da concentração proteica da amostra, prepare a amostra para aplicação no gel, desnaturando a proteína.
Utilize um tampão de amostra contendo um detergente desnaturante iônico, como dodecilsulfato de sódio ou SDS. Ferva a mistura a 95-100 °C por cinco minutos. Usando um gel pré-moldado comercialmente disponível, as proteínas podem ser rapidamente separadas com base no peso molecular.
Encha a unidade de eletroforese com tampão de corrida, que pode ser preparado a partir de reagentes oferecidos pela linha química Omni PU. Carregue a primeira fileira do poço com o marcador proteico trail mix. Este marcador possui três bandas de referência que permitem o monitoramento durante a eletroforese.
Após a coloração do gel, 10 bandas são visíveis, variando de 10 a 225 kilo Daltons. Carregue a amostra desnaturada nos poços restantes. Execute o gel a 220 volts por uma hora.
Uma vez que as proteínas tenham se separado, corar o gel com azul de kumasi para garantir que as proteínas tenham migrado de maneira uniforme e homogênea, utilizando corante rápido e corante ultrassensível, que é pronto para uso, sem necessidade de DS. Assim como proteínas com carga elétrica podem ser induzidas a migrar através de um gel em um campo elétrico, as proteínas podem ser transferidas em um campo elétrico do gel para uma membrana, como NITROCELULOSE ou PVDF. Ao usar membranas de PVDF, mergulhar a membrana em metanol por alguns minutos, seguido por uma equilibração em tampão de transferência gelado por cinco minutos. Também mergulhar o gel por alguns minutos em tampão de transferência gelado; a equilibração evita a contração do gel durante a transferência.
Para uma transferência úmida, monte um sanduíche contendo o gel e a membrana entre esponja e papel. Em seguida, prenda firmemente o conjunto após garantir que nenhuma bolha de ar tenha se formado entre o gel e a membrana. Mergulhe o sanduíche no tampão de transferência e aplique um campo elétrico.
As proteínas com carga negativa migrarão em direção ao eletrodo com carga positiva. A membrana, então, as retém, ligando-se a elas e impedindo que continuem. Após a conclusão da transferência, visualize as proteínas para garantir uma transferência uniforme e ausência de bolsas de ar.
Isso pode ser facilmente feito com o corante para Western blot de alerta vermelho. Este corante está pronto para uso e a desscoloração pode ser realizada facilmente com água. Este é o gel após ter sido dessaturado por lavagem em água; antes que a membrana possa ser provada com anticorpo, a membrana é bloqueada.
Para evitar ligação inespecífica, bloqueie a membrana com reagentes de bloqueio de alta qualidade. Para evitar um aumento no fundo, incube-a em solução de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente sob agitação suave, depois lave a membrana três vezes em TBST ou PBST após a incubação. Esses tampões podem ser facilmente e convenientemente preparados usando comprimidos de tween TBS e comprimidos de tween PBS, respectivamente.
Após a membrana ter sido bloqueada e lavada, ela pode ser incubada com o anticorpo primário. Aplique o anticorpo primário utilizando a solução um do Signal Boost, que permite uma amplificação significativa do sinal. Prepare o anticorpo primário na solução um e incube a membrana por uma hora.
Não é necessário adicionar agentes bloqueadores adicionais após a incubação. Lave a membrana com TBST. Em seguida, incube a membrana com o anticorpo secundário diluído na solução dois do amplificador de sinal por uma hora.
Por fim, lave novamente a membrana várias vezes com TBST para detecção de anticorpos secundários conjugados à HRP. A detecção por quimioluminescência melhorada ou ECL é tradicionalmente utilizada neste passo. O reagente ECL de passo rápido é empregado, pois não requer a mistura de luminol ou potencializador.
Basta pulverizar a membrana algumas vezes, incubá-la por dois minutos e revelá-la utilizando filme de raios X. O Rapid Step oferece sensibilidade na faixa de picogramas baixos, bem como emissão mais leve por até duas horas após a adição do substrato. Os marcadores proteicos Trail mix permitem o rastreamento de proteínas durante a eletroforese quando comparados aos protocolos padrão de Western blot.
O Signal Boost permite uma faixa dinâmica e sensibilidade maiores. Por fim, pode-se obter uma sensibilidade superior utilizando o passo Rápido em vez de reagentes ECL tradicionais. Acabamos de mostrar como realizar o Western blot de forma eficiente e econômica com uma gama abrangente de produtos.
Lembre-se de que a qualidade dos seus resultados depende da qualidade dos seus reagentes. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo demonstra a técnica de Western blotting, um método essencial para detectar proteínas específicas em amostras de tecidos. O procedimento destaca a importância do uso de reagentes de alta qualidade e protocolos adequados para obter resultados ideais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Análise de Proteínas
- Técnicas Analíticas
Antecedentes
- A eletroforese em gel seguida de transferência para membrana é uma técnica analítica amplamente utilizada.
- Ela permite a detecção e quantificação de proteínas específicas.
- A técnica envolve várias etapas, incluindo preparação da amostra, eletroforese em gel e transferência para uma membrana.
- Reagentes e protocolos adequados são cruciais para resultados bem-sucedidos.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o procedimento de Western blotting.
- Enfatizar a importância da qualidade dos reagentes para obter resultados confiáveis.
- Fornecer um guia passo a passo para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Preparação da amostra utilizando centrifugação e reagentes de extração de proteínas.
- Desnaturação das proteínas com SDS e carregamento em gel.
- Eletroforese para separar as proteínas com base no peso molecular.
- Transferência das proteínas para uma membrana seguida por detecção com anticorpos.
Resultados Principais
- Obteve-se separação e transferência bem-sucedidas de proteínas.
- Os passos de bloqueio e sondagem foram demonstrados de forma eficaz.
- Foi observada sensibilidade de detecção aumentada com o uso de reagentes específicos.
- Obteve-se visualização clara das proteínas utilizando métodos de detecção por ECL.
Conclusões
- A eletroforese em gel pode ser realizada de forma eficiente com os protocolos adequados.
- A qualidade dos reagentes impacta significativamente os resultados.
- Essa técnica permanece uma ferramenta fundamental na análise de proteínas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O western blot é um método fundamental de detecção de proteínas que sustenta a validação de alvos e estudos mecanicistas na pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico&Suas saídas quantitativas e especificidade baseada em anticorpos permitem avaliação confiável da expressão proteica, modulação de vias e presença de biomarcadores em fluxos de trabalho de descoberta e pré-clínicos. O western blot confiável sustenta a tomada de decisões preditivas e o avanço de portfólios com ajuste de risco.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta de alvos proteicos e componentes de vias em amostras biológicas.
- Apóia a validação funcional de alvos candidatos por meio da detecção quantitativa de proteínas.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao confirmar a modulação dos pontos finais moleculares pretendidos.
- Fornece evidências reprodutíveis de engajamento do alvo e especificidade da via.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece sistemas validados de detecção de proteínas para triagem posterior e avaliação de compostos.
- Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de protocolos e controles definidos.
- Oferece suporte à medição quantitativa da abundância de proteínas para análises comparativas.
- Prepara plataformas robustas para triagem em larga escala e integração de dados entre estudos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a detecção de proteínas com biomarcadores relevantes para doenças, garantindo continuidade translacional.
- Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica, confirmando a modulação proteica em modelos relevantes.
- Apoia o avanço com ajuste de risco ao fornecer dados quantitativos e reprodutíveis sobre proteínas.
- Permite insights mecanicistas sobre os efeitos de compostos e vias biológicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O blotting ocidental integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, fornecendo uma capacidade analítica reutilizável em todo o continuum de P&D.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao quantificar alvos proteicos e efetores downstream.
- Triagem: Fornece detecção de proteínas pronta para ensaios e reprodutível para avaliação de compostos e confirmação de hits.
- Análises: Oferece leituras quantitativas e confirmação do peso molecular para análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Alinha a detecção de proteínas a modelos de doenças e estratégias de biomarcadores, quando apoiado pelo fluxo de trabalho.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e escalável para análise de proteínas em múltiplos programas e equipes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Permite fluxos de trabalho padronizados, reprodutíveis e escaláveis para detecção de proteínas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao fornecer dados robustos sobre proteínas.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos em descoberta e pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em extração de proteínas, eletroforese e detecção baseada em anticorpos.
- Requer acesso a equipamentos de eletroforese, transferência e imagem de quimiluminescência.
- Exige padronização entre equipes de protocolos, reagentes e controles para reprodutibilidade.
- Pode exigir adaptação dos protocolos para diferentes tipos de amostras ou sistemas modelo.
- Depende da especificidade dos anticorpos e da qualidade dos reagentes para resultados ideais.
