Clonogênica Ensaio: células aderentes

Olá, meu nome é Lum e atualmente estou fazendo meu doutorado no Instituto do Coração e Diabetes BE IDI, sob a supervisão da Dra. Tom Carianne, chefe do Laboratório de Medicina Epigenômica. Neste vídeo, demonstrarei o procedimento conhecido como ensaio de sobrevivência clonogênica. Esta é uma técnica com 50 anos de existência, que permite avaliar o impacto de diferentes tratamentos, como exposição à radiação ou agentes químicos, na viabilidade reprodutiva celular.

O ensaio de sobrevivência congênico é uma técnica central na biologia da radiação para avaliar a sensibilidade à radiação de diferentes linhagens celulares e testar a eficácia de diversos compostos radioprotetores ou radiosensibilizantes. Ao utilizar uma linhagem celular aderente, o ensaio de sobrevivência criogênico consiste em três fases. Primeiro, o tratamento de uma monocamada de células aderentes.

Em segundo lugar, o preparo de uma suspensão de células simples e o plaqueamento de um número conhecido de células em placas pintadas, e em terceiro lugar, a coloração, contagem e as colônias formadas após um período de incubação. Neste vídeo, estarei utilizando células de linhagem imortalizada de cino humano para demonstrar como o ensaio de polônio pode ser usado para determinar as propriedades radioprotetoras do antioxidante natural. Frascos de 1225 M são semeados com células em cinco mililitros de meio previamente, de modo que no dia do experimento haja 1 milhão de células por frasco.

50 microlitros do fármaco são adicionados em diferentes concentrações aos cinco mililitros de meio em cada frasco devidamente identificado para atingir a concentração desejada; cinco concentrações são utilizadas, bem como um controle de veículo, neste caso, PBS. Após a adição do fármaco, as células são incubadas por uma hora nas condições apropriadas para a linhagem celular utilizada. Após a incubação, os grupos experimentais, excluindo o grupo controle, são irradiados na dose escolhida, que neste caso é quatro gray produzida por uma fonte de césio emissora de raios gama.

Após a irradiação, os meios são descartados e cada frasco é lavado com dois mililitros de PBS por cinco minutos. Após a remoção do PBS, adiciona-se dois mililitros de tripsina a 0,05% em cada frasco para destacar as células aderentes A do frasco. Em seguida, adiciona-se cinco mililitros inferiores de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal em cada frasco para desativar a tripsina.

O conteúdo completo do fasc é então transferido para tubos cónicos de 10 mililitros rotulados. Após a conclusão, esses tubos são centrifugados por cinco minutos, após o que o sobrenadante é descartado cuidadosamente sem perturbar o pellet, e cinco mililitros de meio crecy são adicionados a cada tubo. A concentração de células de cada amostra é calculada, bem como o volume necessário de cada amostra para atingir a concentração final de células a serem semeadas em cinco placas de Petri por amostra, com cinco mililitros de meio cada.

Por exemplo, para o grupo controle, 100 células são semeadas por placa, portanto, o volume necessário para obter 500 células por 25 mililitros é calculado; para amostras mais concentradas, realize uma diluição de 10 vezes ou uma diluição serial de 100 vezes para minimizar o erro envolvido ao usar volumes menores que 100 microlitros. Agora, o volume previamente calculado é preparado em um tubo tipo Falcon contendo 25 mililitros de meio para cada amostra. As amostras podem então ser transferidas para placas previamente identificadas, adicionando cinco mililitros a cada placa para facilitar o manuseio e o transporte.

Armazene as placas em um recipiente grande, estéril ou desinfetado. Em seguida, coloque as placas em uma estufa umidificada nas condições apropriadas e incube por oito dias. Se for utilizar queratinócitos após oito dias, remova cuidadosamente as placas da estufa e organize-as uma a uma dentro de uma cabine de segurança biológica.

Manuseie o local com cuidado para não perturbar quaisquer colônias que tenham se formado. Remova as tampas e adicione cinco ml de salina 0,9% a cada placa para lavá-las. Direcione a ponta do pipetador para o canto da placa e evite tocar o fundo da placa para que as colônias não sejam acidentalmente removidas.

Após cinco minutos, aspire cuidadosamente a solução salina. Agora, as colônias são fixadas com três mililitros de 4%formula, e as tampas devem ser substituídas para evitar evaporação. Após 15 minutos a meia hora, a fórmula é aspirada e descartada adequadamente.

As colônias estão agora prontas para serem coradas com violeta de cristal a 0,1%; cinco mililitros são adicionados a cada placa e as tampas são recolocadas após meia hora a uma hora. O corante é então removido com água destilada e as placas são invertidas e deixadas secar durante a noite. As colônias estão agora prontas para serem contadas.

As colônias podem ser contadas manualmente utilizando um microscópio estereoscópico. Qualquer agrupamento de células contendo 50 ou mais células é considerado uma colônia. E isso conclui a nossa demonstração do ensaio de sobrevivência congênico.

A principal vantagem deste ensaio em relação a outras técnicas é que ele é incrivelmente sensível e pode detectar sobrevivência em uma ampla faixa, mesmo após seis ordens de magnitude de morte celular. Essa sensibilidade é alcançada ao semear números maiores de células. Este ensaio pode facilmente ser utilizado para outras finalidades, como testar a citotoxicidade.

Obrigado por assistir.