Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

Este procedimento analisa os efeitos de pequenas GTPases ACE no tráfego de membrana polarizada. Primeiro, injete simultaneamente plasmídeos de DNA que codificam a pequena GTPase ACE e as proteínas repórter nos núcleos celulares de células polarizadas. Em seguida, expresse o DNA em temperaturas que irão deter as proteínas repórter no retículo endoplasmático ou no TGN, enquanto a pequena GTPase se acumula no citosol, e prossiga com o rastreamento da proteína repórter até a superfície celular na presença de cicloheximida para impedir a síntese de novas proteínas.

Por fim, marque a proteína repórter na superfície celular para análise por imunofluorescência. Os resultados obtidos com este ensaio permitem a visualização da alteração na localização superficial por meio de microscopia confocal. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a transfeção, é que, durante os curtos períodos de superexpressão alcançados com microinjeção, os efeitos secundários são mínimos, permitindo-nos estudar os efeitos primários das proteínas de interesse.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de polaridade celular, como a forma pela qual a gtpase pequena regula o tráfego de membrana polarizado. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas individuais necessárias para uma microinjeção bem-sucedida são difíceis de explicar sem auxílio visual. Isole o DNA plasmidial livre de endotoxinas com o kit maxi prep livre de endotoxinas da Sigma Aldrich, conforme o protocolo do fabricante. Para este experimento, utilize três filtros transwell claros de 12 milímetros com porosidade de 0,4 micrômetro para o cultivo.

As células são semeadas com quatro vezes 10 à quinta potência de células MDCK em cada filtro. Após dois dias, examine a cultura em microscópio para verificar se as células estão crescendo em uma monocamada fechada. Para microinjeção.

No dia da microinjeção, prepare placas de 360 por 15 milímetros com cinco litros de meio de crescimento MM mais 15 milimolares de heis e coloque-as em uma incubadora a 39 °C. Além disso, prepare três placas de 12 poços com um mililitro de meio de crescimento MEM mais 50 milimolares de heis e 0,1 miligrama por mililitro de cicloeximida e coloque-as em uma incubadora a 31 °C. Ligue o microscópio de microinjeção, configurado com este microscópio invertido com platina aquecida, objetivas de 10 x e 32 x e um einor femto jet.

Regule a platina aquecida para 39 graus Celsius. Abra também o suprimento do tanque de gás nitrogênio para a mesa pneumática. Agora, dilua o DNA com água filtrada até uma concentração final de 0,2 miligramas por mililitro.

Em seguida, centrifugue o DNA em uma microcentrífuga einor a 13.000 RPM por 30 minutos. Remova a porção superior e coloque em um novo tubo. A seguir, prepare as células MDCK retirando o primeiro filtro do seu recipiente de cultura com a lâmina cirúrgica, recortando o filtro do suporte e colocando-o na placa preparada de 60 por 15 milímetros contendo cinco mililitros de meio de crescimento MEM aquecido a 39 graus Celsius, acrescido de 50 milimolares de heis.

Para pressionar o filtro na placa de cultura, coloque a lâmina cirúrgica no centro do filtro e, em seguida, transfira a placa de cultura para a platina aquecida do microscópio. Carregue duas a três microlitros do DNA diluído em uma agulha de microinjeção. Gire a tampa protetora da agulha e deixe-a cair no chão.

Para posicionar a agulha no suporte, pressione a tecla de menu da injeção e certifique-se de que a válvula está fechada. Parafuse a agulha em seu suporte. Cuidado para não apertar a agulha com muita força.

Como isso pode causar ruptura, pressione a tecla de menu novamente. Assim, a pressão de compensação aplicada impedirá que o meio seja sugado para dentro da agulha durante o procedimento de microinjeção. Por fim, acione o joystick para apagar a referência armazenada e abaixar a agulha sobre as células.

Use o objetivo de 10x e posicione a agulha no feixe de luz acima do líquido. Agora, foque as células. Foque novamente para cima girando a roda de foco 180 graus para cima e localize a agulha.

Mova lentamente a agulha para colocá-la em foco. Em seguida, retire-a do foco novamente. Trabalhe para trazer as células novamente para o foco.

Traga novamente a agulha para o foco. Repita até que a agulha toque a superfície do meio, momento em que um halo será observado. Continue até alcançar o ponto em que as células estejam em foco, mas a agulha ainda esteja desfocada, fora do plano focal.

Agora mude para a objetiva de 32 x e encontre as configurações preliminares. Defina o limite Z tocando a membrana apical com a ponta da agulha e subtraindo cerca de 10 micrômetros, já que os núcleos estão localizados aproximadamente 10 micrômetros abaixo da membrana apical.

Agora, retire rapidamente a agulha alguns mícrons do plano focal. Posicione a agulha acima do núcleo e pressione e solte o botão de injeção do joystick. Comece com 95 PSI para encontrar a pressão de injeção adequada.

Se a pressão for muito alta, as células estouram. Se a pressão for muito baixa, um ponto branco persiste, mas nada mais acontece. Realize uma injeção bem-sucedida que envolva uma mudança de fase sem alteração no tamanho da célula.

Injete de 100 a 500 células dentro do orifício da lâmina cirúrgica que está posicionado sobre as células. Em seguida, coloque as células com a placa de cultura e a lâmina cirúrgica em uma incubadora a 39 graus Celsius e incube por duas horas. Por fim, transfira as células para a placa de 12 poços preparada com um mililitro de MEM contendo 50 milimolar de 0,1 miligrama por mililitro de ciclo-heide e incube por duas horas a 31 graus Celsius.

Para evitar o desbotamento do sinal de GFP expresso, proteja os espécimes da luz cobrindo-os com papel alumínio durante todos os procedimentos subsequentes de coloração de superfície. Coloque as células em uma placa de cultura sobre uma placa de metal em gelo e lave. Uma vez com PBS gelado mais mais, posicione um pedaço limpo de paraforma sobre a placa de metal em gelo e adicione gotas de 30 microlitros de um anticorpo que reconheça o domínio ecto da proteína de interesse usando uma pipeta.

Agora, posicione o filtro contendo as células de cabeça para baixo sobre a gota e adicione algumas gotas de anticorpo no lado oposto do filtro. Incube por uma hora no gelo. Lave as células três vezes com PBS gelado mais mais e fixe com paraformaldeído a 3% por 15 minutos à temperatura ambiente.

Prossiga com a lavagem das células uma vez com PBS mais mais e equilibre em PBS mais mais por cinco minutos. Incube agora as células no tampão bloqueador permeabilizante. Incube por uma hora à temperatura ambiente, dilua os anticorpos primários na proporção de um para 200 no BPB para detectar a RAB GTPase expressa, centrifugue por 10 minutos a 13.000 rpm, pipete 30 microlitros da solução de anticorpo sobre lâmina limpa colocada em câmara úmida.

Coloque as células sobre o filtro de cabeça para baixo nas gotas de anticorpo e incube por uma hora. À temperatura ambiente, recoloque as células novamente com o lado certo para cima em uma placa de 12 poços e lave cinco vezes durante 30 minutos com BPB à temperatura ambiente após a incubação com os anticorpos secundários apropriados, incluindo uma etapa de lavagem.

Mergulhe as células no filtro três vezes em água desionizada e coloque-as com o lado correto voltado para cima em lâminas microscópicas com 10 microlitros de meio de montagem. Coloque um micro-objeto de vidro de 18 por 18 milímetros em cima e, usando lenços faciais, pressione suavemente a lamínula sobre as células. Por fim, selar com esmalte no procedimento simulado de injeção contendo apenas o plasmídeo que codifica V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. A proteína é entregue à superfície basolateral de células MDCK bem polarizadas, conforme indicado pela coloração superficial vermelha em células que não estão bem polarizadas.

Parte da proteína de fusão GFP será entregue à membrana apical. Se os espécimes controle apresentarem essa aparência, os dados não são confiáveis e o experimento deve ser repetido com células melhor polarizadas. Observe que nem toda a proteína de fusão expressa em GFP é entregue à membrana basolateral durante o período de marcação a 31 graus Celsius, como evidenciado pelo intenso sinal verde intracelular para a proteína total. Uma vez dominada, esta técnica deve levar aproximadamente de 10 a 12 horas após o seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de tráfego de membrana explorarem proteínas reguladoras em células epiteliais polarizadas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar proteínas em células epiteliais polarizadas utilizando a técnica de microinjeção.