Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

Meu nome é Jiang, sou pesquisador pós-doutorando da Harvard e do MIT, Saúde, Ciência e Tecnologia. Minha especialização neste laboratório é desenvolver dispositivos inovadores de predição para estudar o comportamento celular. Consigo criar dispositivos de gradiente muito inovadores, bem como integrá-los ao meu dispositivo de predição.

O dispositivo TC pode manipular com precisão a interação célula-célula e a interação celular, bem como o contato com fatores solares celulares. Assim, utilizando o sistema TC, posso estudar e compreender a biologia celular básica, bem como aplicar conceitos da biologia do desenvolvimento e da bioengenharia de células-tronco. Meu nome é Amir Manchi e sou aluno de graduação no laboratório do professor Haan, na Divisão de Ciências da Saúde e Tecnologia de Harvard e MIT.

E tenho trabalhado com dispositivos microfoliculares e temos tentado, como prova de princípio, demonstrar que dispositivos microfluídicos são equipamentos com grande potencial para o cultivo de células e para a realização de diferentes estudos, como estudos de toxicidade. Também tentamos estudar e otimizar a caracterização do fluxo dentro desses dispositivos em função de taxas de fluxo, geometria e outros parâmetros distintos. Neste momento, estamos partindo da sala de microfabricação e o que vamos fazer é produzir alguns dispositivos microfluídicos. Para que os dispositivos microfoliculares sejam viabilizados, precisamos de padrões em pastilhas de silício e de moldes em PDMS sobre eles. Esse polímero PDMS é, na verdade, uma mistura de duas substâncias diferentes.

É uma mistura de base de elastômero de silicone e agente endurecedor de elastômero de silicone. A maneira como misturamos esses dois componentes é na proporção de 10 para 1, ou seja, 10 partes de base para 1 parte de agente de cura. Agora, quero cerca de 20 gramas da minha base aqui.

Eu preciso também de dois gramas do agente de cura, e o agente de cura é muito menos denso. Ele fluirá muito mais rápido e terei que ter um pouco de cuidado. Então, agora está em torno de 22, e quero misturar a base com o agente de cura.

Então, usarei uma pipeta para fazer isso. Tentarei misturá-lo o máximo possível, de forma bem homogênea. Quero despejar esse polímero de PDMS sobre as pastilhas de silício que já possuem um padrão em sua superfície, e a pastilha de silício ajuda a conferir o padrão aos moldes de PDMS.

Você pode notar que tenho dois substratos de silício bem aqui, e a razão é que um deles é para a camada superior do nosso dispositivo microfluídico e o outro é para a camada inferior. Precisamos de duas camadas em dispositivos microfluídicos porque estamos tentando criar um canal no interior, e toda a ideia por trás dos dispositivos microfluídicos é permitir que haja fluxo dentro desses canais. Por isso, preciso despejar essa mistura sobre ambos os substratos de silício, já que há muitas bolhas dentro dessa mistura.

Quero remover essas bolhas e o que fazemos é usar vácuo para eliminá-las. Estamos de volta à área principal do laboratório e, como eu disse anteriormente, dentro da mistura de PDMS há muitas bolhas e queremos removê-las. Vou colocar as misturas sobre as pastilhas de silício dentro da câmara de vácuo. Vou fechar a câmara e vou abrir o vácuo. Após esse procedimento, colocaremos as moldes de PDMS dentro de uma estufa durante a noite para torná-las mais sólidas.

Estamos agora no laboratório e queremos montar esses dispositivos microfoliculares. O que vamos fazer é pegar as moldes de PDMS, que ficaram dentro da incubadora durante a noite e que já formaram os padrões presentes nas pastilhas de silício, e vou utilizar dois padrões diferentes. No lado esquerdo, você pode ver o microcanal, que será a camada superior, e no lado direito você pode ver alguns padrões de linhas verdes, que serão a camada inferior.

E isso é o que formará as ranhuras no interior do microdispositivo. Estou começando a cortar esses géis para poder obter a camada superior, de modo que se separe facilmente da lâmina de silício. O que farei é transferi-lo para esta placa de Petri com a face voltada para cima, de modo que os padrões fiquem voltados para cima.

E vou tentar a mesma coisa para as ranhuras, que eram os padrões de linhas verdes. Essas vão formar a camada inferior. Então, uma vez que o gel for cortado, vou transferi-lo para a placa de Petri e, para evitar poeira sobre os padrões, vou cobri-los com fita adesiva.

O próximo passo é furar as extremidades dos canais para permitir a entrada e saída de células e meio. O que vou fazer é o seguinte: como tenho uma superfície ampla aqui e não consigo ver claramente os padrões, vou usar isto para poder visualizar os canais e, então, furar ambas as extremidades. Assim, vou fazer um furo grande aqui, de modo que haja espaço reservado, e do outro lado vou fazer um furo menor para poder utilizar tubos de polietileno do outro lado.

Estamos agora na sala de microfabricação e o próximo passo é unir as duas superfícies diferentes que temos. Para isso, você utilizará esta máquina, chamada limpeza por plasma, e o processo é denominado tratamento por plasma. O que acontece dentro desta câmara é que teremos um ambiente de plasma e, na interação entre o plasma e a superfície, o plasma quebrará as ligações superficiais fracas e as substituirá por grupos químicos altamente reativos.

O que vai acontecer agora é que vou retirar as fitas que foram colocadas aqui para evitar a poeira e vou inserir esses moldes na câmara. Vou fechar completamente esta porta, primeiro a alimentação, depois a bomba, e então estaremos prontos para começar. Retomaremos em cinco a dez minutos.

Agora quero desligá-lo, então desligo a bomba e a energia elétrica e, em seguida, abrirei a câmara. Na verdade, há uma pressão negativa aqui, então você pode ouvir o som. Isso acontece por causa da pressão negativa, então retiro lentamente meus moldes.

Como temos ambas as superfícies com os padrões voltadas para cima, vou pegar a camada inferior, colocá-la na minha mão esquerda e, em seguida, pegar a camada superior, inverter e colocá-la sobre os meus sulcos, empurrando então as camadas uma sobre a outra. A resistência e a permanência da adesão são as vantagens do uso dessa máquina de tratamento por plasma. E o que você vê aqui agora é que é possível observar o canal na camada superior e os padrões sulcados na camada inferior, estando pronto para o próximo passo.

E então traga aqui esta sala de cultura, este meio de cultura e, em seguida, abra a tampa da placa. Depois, podemos carregar a fibronectina, retirar 60 microlitros de fibroína e carregar no dispositivo. Em seguida, para gerar um fluxo dentro do dispositivo e induzir um revestimento fino, fazendo vibrar o interior do canal, podemos simplesmente aspirar suavemente na saída.

Depois disso, basta colocar este dispositivo no incubador e aguardar uma hora após o resfriamento de uma hora com vibração no interior do incubador. Retiramos então a amostra do incubador e utilizamos cinco ferrugens, três, três fibras de ferrugem. Realizamos apenas a fusão e esta sombra e depois adicionamos o meio, além de realizar também a contagem celular utilizando o contador de células.

Normalmente, usamos cerca de um milhão de células presas dentro do dispositivo. Assim, após a dissociação, podemos passar algumas vezes um tampão de lavagem e, em seguida, retirar a suspensão celular e carregar o interior do canal, o que facilita o carregamento das células no interior do canal. Você pode simplesmente fluir suavemente utilizando a pipeta de aspiração.

O meio somado e a suspensão superficial aspirada através da célula de saída geralmente é, automaticamente, você sabe, semeando o canal seletivo, o canal global. Depois disso, podemos simplesmente desmontar e colocar no incubador por uma hora, até que a célula esteja completamente espalhada dentro do canal. E então podemos infundir anexina V e o iodeto de propídio, bem como o peróxido de hidrogênio.

Em seguida, estude o ensaio da sua hipótese temporal. Podemos coletar a amostra dentro de um alimento de cultura de tecidos e, então, preparar a solução com dois mililitros de meio DMEM, bem como 20 microlitros de anexina V, 40 microlitros de iodeto de propídio e 100 mililitros de peróxido de hidrogênio. Em seguida, tome o meio de dois mililitros com anexina V, iodeto de propídio e peróxido de hidrogênio, e então insira a seringa posteriormente.

Coloque os dois mil meios de cultura e anexe cinco prop iodeto, hidro perxido. Podemos simplesmente colocar a solução dentro das câmaras e, em seguida, remover a bolha e depois conectar o C bear. Esta é uma câmara Hamilton térmica de mililitros estanque ao gás.

Este aqui é três ursos. Este aqui é teto de teto descartável. Este aqui é agulha de calibre 27.

Este aqui é um tubo de polietileno 20. Após carregar a solução dentro de uma seringa, basta acoplar, empurrar completamente, empurrar novamente e continuar empurrando; às vezes, bata levemente na ponta da seringa para remover as bolhas e, em seguida, puxe a solução. Mais uma vez: empurre completamente, remova as bolhas e, então, aspire suavemente novamente.

Então, pegue a solução para uma refeição e depois podemos trocar a válvula. Empurre, empurre a solução através da válvula de três vias e completamente dentro do tubo. Assim, finalmente, a solução sai pela ponta do nosso tubo e então podemos simplesmente conectar o tubo ao microdispositivo e começar a infundir um microlitro por minuto.