Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de

O objetivo geral deste procedimento é extrair o DNA do parasita da malária e do mosquito a partir das seções do intestino médio e das glândulas salivares de espécimes de anomalias. Isso é realizado primeiramente cortando o mosquito exatamente na junção entre o abdômen e o tórax, separando assim o intestino médio da seção das glândulas salivares. Em seguida, cada seção é moída separadamente em água desionizada.

Em seguida, a suspensão tecidual é lisada e lavada, e o pellet celular é recuperado. Por fim, o pellet celular é reconstituído e fervido, e o DNA é extraído. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram DNA de alta qualidade de mosquito e do parasita da malária, adequado para ser usado como molde na identificação de anomalias, espécies vetoras e genótipos de infecções por malária por meio de PCR e digestão com enzimas de restrição específicas para alelos.

Assim, a principal vantagem dessa técnica muito simples em comparação com métodos existentes, como extração orgânica e métodos de separação, é que ela utiliza pouquíssimos reagentes seguros e facilmente disponíveis, além de exigir muito menos tempo de processamento. Para começar a dissecar o mosquito, coloque-o sobre um pequeno pedaço de paraforma e posicione-o em um microscópio estereoscópico. Cubra-o com uma gota de água desionizada.

Para amaciar o tecido em tamanho, corte cuidadosamente o cadáver do mosquito exatamente na articulação entre o tórax e o abdômen. Assim, separe a cabeça e o tórax da seção abdominal. Transfira cada seção dissecada do mosquito para um tubo microcentrífugo estéril de 1,5 mililitro previamente rotulado com o número de identificação do mosquito e a seção do corpo; descarte o filme de parafina e, usando uma toalha de papel umedecida com álcool a 70%, limpe cuidadosamente a platina do microscópio antes de passar ao próximo mosquito. Para extrair o DNA do mosquito, pipete primeiro 20 microlitros de água desionizada para dentro do tubo da amostra.

E use a ponta da pipeta para triturar a seção submersa do mosquito até obter uma suspensão homogênea. Adicione 100 microlitros de uma solução autoclavada de PBS 1X com 1% de saponina ao homogenato da amostra e vortexie suavemente para misturar. Incube a amostra à temperatura ambiente por 20 minutos.

Em seguida, centrifugue a 20.000 G durante dois minutos e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de PBS 1X. Em seguida, repita a centrifugação.

Adicione 75 microlitros de água estéril desionizada e 25 microlitros de suspensão de resina Cellex 100 a 20% peso por volume em água desionizada e vortexe suavemente para ressuspender o precipitado usando uma agulha hipodérmica estéril de 23 gauge flamejada em bico de Bunsen. Faça um furo na tampa do tubo de amostra.

Ferva a suspensão da amostra em um bloco de aquecimento por 10 minutos. Centrifugue a 20.000 G por um minuto e transfira a solução de DNA para um frasco de armazenamento previamente rotulado para uso como molde em reações de PCR para verificar a qualidade do DNA extraído, amplificando uma região do gene mitocondrial do subunidade quatro da nicotinamida adenina dinucleotídeo desidrogenase de artrópodes, que deve produzir um fragmento de 400 pares de bases. Em seguida, para diferenciar entre espécies de Ananais Gambia, amplifique uma região que flanqueia SNPs na região espaçadora intergênica, que deve produzir fragmentos de 390 pares de bases para Ananais Gambia Sensu Stricto e de 315 pares de bases para Ananais api.

Em seguida, genotipar polimorfismos de resistência a drogas antifolatos em P. falciparum. Realize PCR aninhada para amplificar a região que flanqueia os códons dos aminoácidos 16, 51, 59, 108 e 164. No gene da di-hidrofolato redutase dos parasitas, realize digestão alélica específica do amplicon para detectar resistência a drogas antifolatos.

Polimorfismos associados. Verifique as reações em um gel AROS 2%. Exemplos de resultados de ensaios de PCR para análise da qualidade de extratos de DNA de mosquitos, identificação molecular de RABIS e genotipagem de p. falciparum mostram que o método Kelex simplificado produz resultados semelhantes ao protocolo padrão de salting out, apesar de envolver menos etapas e menos de um quarto do tempo, com qualidade de DNA comparável nos extratos respectivos. Não é surpreendente que as taxas de positividade das amostras em relação a anomalias, espécies irmãs de Gambia, bem como as taxas de infecção por parasitas, não tenham diferido estatisticamente com base no teste qui-quadrado de McNemar.

A adição de BSA às misturas de reação resulta em um aumento geral de resultados positivos na PCR devido à remoção de inibidores da PCR tanto no protocolo Kelex simplificado quanto no de salting out convencional. No entanto, esse aumento não foi estatisticamente significativo, exceto quanto à qualidade do DNA em extratos Kelex. A digestão com enzima de restrição específica para alelos do amplicon de p falciparum permite a genotipagem de infecções de malária no intestino médio e nas glândulas salivares para alelos de resistência a medicamentos, uma vez dominada a técnica.

Essa técnica deve poder ser realizada em cerca de 37 minutos se for executada corretamente.