Quantificação e análise da formação de HO-endonuclease Stimulated translocações cromossômicas por Strand Único Annealing em Saccharomyces cerevisiae

O objetivo geral deste procedimento é determinar o controle genético da formação de translocações por meio da dobragem em cadeia simples em células diploides de levedura brotadora. Isso é realizado primeiramente inoculando culturas com colônias isoladas de um genótipo específico e cultivando-as durante a noite. O segundo passo do procedimento é induzir a formação simultânea de quebras de dupla fita por meio da endonuclease Ho em dois cromossomos, pela adição de galactose às culturas.

A seguir, diluições dessas culturas são repicadas em meios seletivos e não seletivos. O passo final consiste em determinar a frequência de translocação contando as colônias originadas nos meios seletivos e não seletivos. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram o controle genético da formação de translocações por fita simples, mediante alterações na frequência da formação de translocações induzidas pelo ho em cepas de diferentes genótipos.

As implicações dessa técnica estendem-se às consequências da exposição à radiação terapêutica em pacientes com câncer, pois quebras de dupla fita no DNA e a formação de translocações são as principais consequências desse tratamento. Para iniciar o procedimento de determinação das frequências de translocação induzidas, inocular de 10 a 20 culturas independentes de um mililitro de meio de lactato de glicerol Y com colônias simples do genótipo desejado e incubá-las durante a noite a 30 graus Celsius em agitador rotativo. Quando as culturas atingirem a densidade celular desejada, adicionar 20% de galactose às culturas até uma concentração final de 2%. A galactose induzirá a expressão da endonuclease ho, que direcionará quebras de dupla fita no alelo his3δ5' no cromossomo três e no alelo his3δ3' no cromossomo 15; incubá-las por quatro horas a 30 graus Celsius em agitador rotativo.

O próximo passo é crítico para o sucesso do procedimento. A diluição cuidadosa e a semeadura das culturas são imperativas. Se você obtiver frequências de translocação suficientemente reprodutíveis para permitir comparações estatisticamente significativas entre cepas de diferentes genótipos, após quatro horas, semeie a diluição apropriada das culturas em meio sem histidina, bem como em YPD, obtendo aproximadamente de 100 a 200 colônias por placa, e incube as placas a 30 graus Celsius por dois a três dias.

Quando surgem colônias, a frequência de translocação pode ser determinada. As eficiências de plaqueamento antes e após a indução da expressão da endonuclease Ho indicarão se a presença ou ausência de qualquer cromossomo de translocação afeta a capacidade de sobrevivência à formação de quebras de dupla fita (DSB). Fragmenta-se uma cópia de ambos os cromossomos três e 15 para determinar as eficiências de plaqueamento pré-indução.

Primeiro, retire uma alíquota de células de cada cultura de crescimento noturno e determine o número de células contando com um hemocitômetro. Em seguida, use uma diluição apropriada para semear aproximadamente 100 a 200 células em YPD e incube por dois a três dias a 30 graus Celsius até surgirem colônias. Adicione 20% de galactose às culturas restantes até uma concentração final de 2% e incube a 30 graus Celsius por quatro horas para determinar a eficiência de semeadura pós-indução.

Retire uma alíquota de células de cada cultura após quatro horas de indução e determine o número de células usando um hemocitômetro. Plaque aproximadamente de 100 a 200 células utilizando uma diluição apropriada em YPD e incube por dois a três dias a 30 graus Celsius até o surgimento de colônias. Assim que as colônias surgirem nas placas, a eficiência de plaqueamento pode ser determinada. Os clones portadores da translocação putativa podem ser analisados por hibridização em Southern.

Este procedimento utiliza DNA genômico preparado a partir de uma única colônia recombinante de hiss de cada ensaio independente, digerindo aproximadamente quatro microgramas de cada amostra de DNA com a endonuclease de restrição BAM H um, separando os fragmentos digeridos com BAM H um em um gel de agarose a 0,7% e, em seguida, transferindo para uma membrana de nylon com carga positiva, hibridizada com uma sonda marcada com P 32 obtida por priming aleatório com um clone genômico de BMH um de 1,8 KILOBASE, contendo o gene HIS três. Visualize os fragmentos de DNA por autorradiografia ou fosfoimagem. Outra maneira de examinar clones putativos portadores de translocação é por meio de análise de cariótipo cromossômico.

Os cromossomos são inicialmente preparados a partir de recombinantes hiss positivos em tampões de aros, separando os cromossomos em um gel de aros 1% em um campo elétrico homogêneo com fixação de contorno ou chef a 14 graus Celsius. Os seguintes parâmetros são utilizados: primeiro bloco a 14 graus Celsius, tempo de comutação de 72 segundos e 15 horas a seis volts por centímetro; segundo bloco a 14 graus Celsius, tempo de comutação de 122 segundos e 11 horas a seis volts por centímetro. Ao final da eletroforese, visualize os cromossomos corando o gel com brometo de AUM por 30 minutos, seguido de irradiação com UV e posterior transferência dos cromossomos para uma membrana com carga positiva por ação capilar.

Em condições desnaturantes, hibridiza-se com sonda marcada com P 32 obtida por priming aleatório com um clone genômico de 1,8 quilobase bam H um bam H um contendo o hiss. Três genes visualizam cromossomos por autorradiografia ou imagem de fosfoimaging. A frequência de translocações cromossômicas pode ser calculada dividindo o número de colônias fototróficas de histamina pelo número total de células viáveis determinado por plaqueamento em YPD.

Neste exemplo, a frequência de recombinação calculada é de cerca de 3%. O ensaio para frequências de translocação estimuladas por ho pode ser realizado usando cepas de diferentes genótipos para comparar as diferenças na capacidade de reparar quebras de fita simples por meio de fita simples. Um joelho, como mostrado neste gráfico representativo. As frequências de translocação obtidas tanto seletiva quanto não seletivamente com o homozigoto nulo delta RAD 51 foram estatisticamente diferentes daquelas obtidas nas mesmas condições com a cepa selvagem, antes e após o plaqueamento de indução.

As eficiências são determinadas dividindo o número total de células formadoras de colônias viáveis pelo número total de corpos celulares na cultura, determinado por contagem em hemocitômetro, conforme mostrado nesta tabela antes e após o plaqueamento de indução. As eficiências não diferiram significativamente para células do tipo selvagem, o que sugere que a presença ou ausência de qualquer cromossomo de translocação não afeta a capacidade de sobrevivência. Formação de quebras de dupla fita (DSB).

Clones portadores de translocação putativa podem ser analisados por meio de hibridação genômica Southern blot. Uma representação gráfica dos cromossomos relevantes antes e após a formação da translocação é mostrada aqui. Os tamanhos dos fragmentos de restrição contendo sequências relevantes, gerados pela digestão com BAM H um do DNA genômico de cepas parentais e recombinantes e revelados em hibridizações por meio de uma sonda de 1,8 quilobases BAM H um, são indicados.

Seus três clones genômicos são listados em pares de quilobases para análise por Southern blot. O DNA genômico é digerido com a endonuclease BMH I e hibridizado com uma sonda de 1,8 quilobase marcada com P-32. A sonda HIS três é utilizada para visualizar esses fragmentos diagnósticos.

Fragmentos de 0,8 quilobase de HIS três delta, 201,7 quilobase de hiss três delta três linhas primas, quatro quilobase de T3 15, cinco quilobase de T15 três e oito quilobase de hiss três delta cinco linhas primas. A trilha A é o diploide parental. A trilha B é um recombinante de translocação não recíproca hiss positivo e a trilha C é uma translocação recíproca his positivo.

A análise recombinante de cromossomos por BLO também pode ser empregada para examinar clones portadores de translocação. Cromossomos intactos preparados em tampões de agarose são separados por eletroforese CHEF e o gel é corado com brometo de irídio e visualizado sob luz UV. Os cromossomos separados são então transferidos para nylon e hibridizados com a sonda de 1,8 quilobase marcada com P-32.

Seu três sondas para visualizar o cromossomo intacto de 1,1 megabase, o cromossomo de translocação T15:3 de 15,8 megabases, o cromossomo de translocação T3:15 de 0,6 megabase e o cromossomo três intacto de 0,3 megabase. A linha A é o progenitor desdobrado. A linha B é A his mais recombinante com translocação não recíproca, e a linha C é A his mais recombinante com translocação recíproca.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a frequência de formação de translocações após múltiplas quebras de fita dupla induzidas por ho.