Microscopia fluorescente sem lente em um Chip

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma plataforma de microscopia fluorescente sem lentes e em chip para imageamento de objetos fluorescentes em um campo de visão ultra amplo. Para isso, um filtro fino de absorção e uma placa de fibra óptica são cuidadosamente colocados sobre uma matriz de sensores optoeletrônicos, ou CCDC moss, e, em seguida, um chip microfluídico é posicionado sobre a placa. Em seguida, um prisma é montado com o microchip utilizando óleo de casamento de índice.

A citação fluorescente é realizada através da face lateral de um prisma romboide, e a iluminação holográfica é feita através da face superior do mesmo prisma. Em última análise, imagens microscópicas de alta resolução podem ser obtidas a partir das imagens fluorescentes adquiridas mediante a decodificação das imagens brutas por meio de algoritmos digitais. Se necessário, os objetos fluorescentes decodificados podem ser contados automaticamente utilizando uma interface desenvolvida sob medida.

Lente em chip. A imagem em geral tem como objetivo substituir microscópios ópticos baseados em lentes volumosas por designs mais simples e compactos. Esta plataforma tecnológica emergente tem o potencial de eliminar a necessidade de componentes volumosos e de alto custo por meio de novas teorias e algoritmos digitais de reconstrução.

A lista de lentes na plataforma de imagem em chip compreende diversos componentes ópticos, incluindo uma matriz de sensores digitais, uma fonte de iluminação incoerente, um prisma, um filtro de absorção e uma placa de face de fibra óptica, ou um cone de fibra óptica. Nesta plataforma, diferentes tipos de matrizes de sensores podem ser utilizados para a detecção do sinal fluorescente proveniente de microobjetos-alvo. Para os fins deste vídeo, será utilizado um dispositivo acoplado por carga, e uma fonte de luz incoerente, como um simples diodo emissor de luz, é usada para a excitação da fluorescência.

Dois métodos diferentes de filtragem de excitação são usados em paralelo para criar o fundo de campo escuro necessário, conforme mostrado neste diagrama. Primeiro, um prisma de vidro ou uma hemisfério de vidro é utilizado para criar reflexão interna total ou TIR na superfície inferior do chip microfluídico que contém as amostras de interesse. Paralelamente a isso, um filtro de absorção de baixo custo é usado para remover a luz de excitação dispersa fracamente que não obedece ao processo de TIR.

Após a rejeição bem-sucedida da excitação por meio desses dois mecanismos, apenas a emissão fluorescente das amostras é adquirida no plano do detector. Apesar de uma abertura numérica de detecção tão grande, as manchas fluorescentes brutas na matriz de sensores tornam-se bastante amplas, o que exige engenharia para melhor controlar a dispersão espacial desse sinal fluorescente. Uma placa de fibra óptica será colocada entre os planos do objeto e do sensor como alternativa a uma placa comum.

Uma placa frontal de fibra óptica cônica, que possui uma densidade significativamente maior de cabos de fibra óptica em sua face superior em comparação com a inferior, pode ser utilizada para obtenção de imagens com maior resolução por meio de ampliação. Os chips microfluídicos usados nesta plataforma são fabricados utilizando paredes de poli(dimetilsiloxano) colocadas sobre lâminas de vidro para criar os microcanais necessários para o início da montagem da plataforma de imagem em chip sem lentes. Primeiro, remova o vidro de cobertura do arranjo de sensores optoeletrônicos usando uma caneta a vácuo, depois coloque suavemente um filtro absorvente fino sobre a área ativa do detector.

Posicione uma placa de fibra óptica sobre este filtro de absorção. Em seguida, coloque o chip microfluídico fabricado diretamente sobre o arranjo de fibras ópticas. A seguir, um prisma de vidro é montado acima do chip microfluídico usando óleo de casamento de índice, de modo que o índice de refração da interface seja igual ao índice de refração do vidro.

Conecte as fontes de luz a cabos de fibra óptica utilizando conectores FC. Um dos aspectos mais difíceis deste procedimento é o alinhamento dos componentes. Alinhe cuidadosamente as distâncias entre os componentes, a posição e o ângulo da iluminação.

Por fim, mova a fibra de iluminação lateral mais próxima ao prisma e ajuste seu ângulo para garantir que ocorra reflexão total interna na interface vidro-ar correspondente aos chips microfluídicos. O substrato inferior, diversas células ou modelos animais pequenos podem ser imageados usando esta plataforma em chip, mas, para fins desta demonstração, serão imageados glóbulos brancos. Para marcar os glóbulos brancos com um corante fluorescente, primeiro misture cerca de 100 microlitros de sangue total com cerca de um mililitro de tampão de lisagem de glóbulos vermelhos, incube por aproximadamente três minutos à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugue a solução sanguínea.

Após remover a camada superior utilizando uma micropipeta, re-suspenda a camada do pellet em solução salina tamponada com fosfato para marcar o ácido nucleico das células com corante fluorescente, adicione SYTO 16 à suspensão re-suspensa e, em seguida, incube a amostra por cerca de 30 minutos no escuro, à temperatura ambiente. Após 30 minutos, centrifugue a amostra marcada. Remova o sobrenadante para reduzir o ruído de fundo devido à emissão fluorescente de corantes não ligados.

Reese ressuspendeu o pellet de células brancas do sangue em cerca de cinco mililitros de PBS. A amostra está agora pronta para ser carregada no chip microfluídico para imagem fluorescente sem lente em chip. Antes da aquisição de imagens das células brancas do sangue, a plataforma de imagem deve ser calibrada utilizando microesferas fluorescentes.

Prepare uma amostra diluída de microesferas utilizando água desionizada e solução bruta de esferas. Usando uma seringa com agulha fina, injete essa amostra inicial no chip microfluídico a partir do lado das paredes de PDMS.

Após montar os componentes para realizar a imagem fluorescente em chip, adquira imagens brutas de microesferas fluorescentes utilizando a interface personalizada do LabVIEW por meio de um computador. Certifique-se de verificar se há pelo menos 20 imagens de microesferas fluorescentes isoladas em todo o campo de visão. Salve os dados de calibração, que serão usados posteriormente para calibrar e extrair a função de espalhamento pontual da plataforma de microscopia fluorescente sem lente.

Remova o chip microfluídico contendo a amostra de microesferas fluorescentes e desacople o prisma desse chip. Injete a amostra de glóbulos brancos previamente preparada em outro chip microfluídico não utilizado, pelo lado das paredes de PDMS. Em seguida, monte os componentes novamente nas mesmas condições experimentais, especialmente quanto às distâncias e à potência de excitação.

Adquira as imagens brutas de células sanguíneas brancas utilizando o sistema personalizado em ambiente de laboratório com os mesmos parâmetros de software usados para as microesferas fluorescentes. Os dados de calibração e as imagens brutas das células sanguíneas brancas são então utilizados para criar imagens de maior resolução no MATLAB por meio de processamento digital. São apresentados aqui resultados representativos de imagens fluorescentes em campo amplo com lente "on-chip" de uma mistura contendo partículas verdes fluorescentes de quatro mícrons e 10 mícrons, para fins comparativos, com microscópio 10 x.

Imagens objetivas também são fornecidas, as quais apresentam boa concordância com as imagens fluorescentes sem lente mostradas. A seguir, um resultado de imagem fluorescente ampla sem lente de uma mistura contendo partículas fluorescentes verdes de 10 mícrons e vermelhas de 10 mícrons. As imagens fluorescentes sem lente fornecem uma correspondência razoável com imagens obtidas com objetivo de microscópio de 10 x das mesmas amostras.

Esta figura apresenta uma comparação de desempenho entre a desconvolução Lucy-Richardson e a amostragem compressiva baseada em algoritmos de decodificação para a imagem de diversos pares de microesferas de 10 mícrons. A linha superior ilustra as imagens fluorescentes brutas sem lente, nas quais as imagens inseridas mostram as comparações ao microscópio das mesmas partículas, obtidas com uma objetiva de 10x. A linha intermediária demonstra os resultados da decodificação compressiva, enquanto a linha inferior ilustra os resultados da desconvolução Lucy-Richardson. DDCS e DLR referem-se às distâncias entre centros, imagens ao microscópio, imagens decodificadas por CS sem lente e imagens desconvolutas por LR sem lente, respectivamente.

Em seguida, ilustra-se o processamento digital de imagens brutas com lente e menor fluorescência. Utiliza-se um algoritmo baseado em amostragem compressiva para alcançar resolução espacial inferior a quatro mícrons, resolvendo pares de microesferas com diâmetro de dois mícrons estreitamente agrupados. Os insets mostram comparações com objetiva de microscópio de 40 x, que concordam muito bem com as imagens fluorescentes decodificadas.

Aqui, D refere-se às distâncias entre centros em imagens de microscópio. Enquanto DCS refere-se às distâncias entre centros na lente CS decodificada, imagens menos fluorescentes. Esta figura mostra os resultados da imagem sem lente de células sanguíneas brancas marcadas fluorescentemente.

As imagens brutas sem lente são decodificadas rapidamente usando um decodificador baseado em CS, o qual apresenta excelente concordância com uma imagem de microscópio convencional da mesma amostra obtida com uma objetiva de 10 x. Além da obtenção de imagens, se necessário, os objetos fluorescentes decodificados também podem ser contados automaticamente usando uma interface desenvolvida sob medida para aplicações de citometria em chip. Ilustrada aqui está uma interface personalizada e automatizada para contagem de objetos fluorescentes no Matlab. Acabamos de demonstrar o procedimento para microscopia fluorescente sem lente de células marcadas e microesferas em um campo de visão de oito centímetros quadrados.

Essa plataforma de imagem comparada de navios com o decodificador compressivo rápido logo atrás será bastante variável para citometria de alto rendimento, análise de microrraros e aplicações em pesquisas com células reais.