Um protocolo simples para agregação plaquetária mediada por
16 de maio de 2013
Este método investiga o fenótipo de aglutinação das plaquetas mediada Plasmodium falciparum Infectados hemácias (CHA) em isolados clínicos. Isto é realizado através do isolamento e da co-incubação do plasma rico em plaquetas e uma suspensão de CH.
Este procedimento oferece algumas diretrizes padronizadas para realizar ensaios de agregação mediados por plaquetas de isolados clínicos ou laboratoriais de Plasmodium falsa parem. Primeiro, colete sangue de um paciente infectado e obtenha eritrócitos parasitados por centrifugação, depois cultive e purifique as fases assexuais maduras. Em seguida, colete sangue de um doador saudável com o objetivo de preparar e padronizar o plasma rico em plaquetas por centrifugação.
Combine as plaquetas e os eritrócitos parasitados para o ensaio de agregação. Diz-se que os resultados de microscopia de imunofluorescência podem mostrar agregados de P. falciparum mediados por plaquetas. Esta técnica é especificamente projetada para medir o fenótipo de agregação do Plasmodium falciparum.
Isolados clínicos em um ambiente com poucos recursos. Variações mínimas nos procedimentos têm sido relatadas como capazes de aumentar a influência no resultado do ácido grumoso no campo. Era, portanto, necessário um protocolo claro e fácil de seguir, adaptado a ambientes com poucos recursos, para padronizar os locais de campo endêmicos para malária. Em um vacutainer com citrato de sódio, colete aproximadamente cinco mililitros de sangue total de um hospedeiro não exposto à malária ou 2,5 mililitros de sangue de pacientes com malária CM ou SM.
Centrifugue o sangue total a 250 Gs durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante turvo para um tubo limpo de 15 mililitros. Lembre-se de que as plaquetas são facilmente ativadas por variações de temperatura e choques físicos.
Conte a suspensão de PRP utilizando uma câmara de Neubauer, hemocitômetro, e ajuste à concentração desejada com PBS para obter o pellet de plasma pobre em plaquetas; remova a maioria das plaquetas de uma porção da fração de PRP por centrifugação a 1500 ×g por 10 minutos. Armazene as frações de PRP e PPP a quatro graus Celsius por até oito a 10 dias. Idealmente, utilize plaquetas frescas para o ensaio de agregação.
Lave os glóbulos vermelhos periféricos em pelote três vezes com cinco a 10 mililitros de RPMI 1640 em um frasco de cultura. Suplemente os GRP com meio de cultura padrão para malária e glóbulos vermelhos frescos não infectados para obter um hematócrito de 5%. Sature os frascos de cultura com uma mistura de 92,5% de nitrogênio, 2,5% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, feche e cultive para obtenção de parasitas maduros a partir de PBMCs do paciente.
Incube o frasco de cultura por 24 a 36 horas em uma estufa a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Coloque aproximadamente 10 a 15 microlitros de sangue em uma extremidade de uma lâmina de vidro fosca apoiada sobre uma superfície plana. Toque a gota de sangue com a borda de uma segunda lâmina até que o sangue se espalhe uniformemente ao longo da borda da segunda lâmina, mantendo esta lâmina em um ângulo de 45 graus.
De forma rápida mas suave, sem exercer muita pressão, espalhe uniformemente o sangue pelo primeiro lâmina. Em seguida, seque ao ar a película fina de sangue e desidrate a área do espécime com metanol durante 10 segundos. Depois, seque novamente ao ar e, a seguir, imerja o espécime em 2%keem.
Mantenha por pelo menos 10 minutos. Lave abundantemente até que a água saia limpa e seque ao ar. Examine as amostras sob uma lente de imersão a óleo de 100 x em um microscópio óptico.
Em seguida, purifique e sincronize os PFS parum maduros, PRBC, conforme descrito no protocolo textual. Transfira toda a cultura para um tubo estéril e limpo de 15 mililitros. Peliculize as células por centrifugação à temperatura ambiente a 370 ×g por cinco minutos.
Agora, aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Em seguida, ressuspender as células de modo que uma metade do volume total seja jello fusing, um terço da segunda metade seja meio livre de proteína e dois terços da segunda metade sejam pbcs.
Transfira a suspensão para um tubo estéril de 15 mililitros e incube por 15 a 20 minutos em uma estufa a 37 graus Celsius até que uma clara demarcação se forme entre as camadas superior e inferior. Transfira cuidadosamente a camada superior para um tubo estéril novo de 15 mililitros e adicione 10 mililitros de RPMI fresco. Centrifugue a 370 a 430 ×g por cinco minutos. Em seguida, despreze cuidadosamente o sobrenadante.
Agora, avalie o parasitismo e o estágio de desenvolvimento por meio de esfregaço fino de sangue e examine ao microscópio de luz conforme descrito anteriormente. Ajuste a suspensão de P RBCs obtida após a flutuação em gel de plasma para um vezes 10 à oitava potência de P RBCs por microlitro em um tubo novo de 1,5 mililitro. Suspenderemos os pbcs em 5% de hematócrito com aine orange ou brometo de atherium a 20 microgramas por mililitro, concentração final, e PRP em 10% do volume total.
Da mesma forma, prepare os seguintes controles: hemácias não infectadas e PRP e PRBC com PPP para determinar o papel das plaquetas na aglomeração das PBC. Agora, transfira a suspensão para um frasco de 2 mL com tampa rosqueável. Coloque o frasco sob agitação suave, girando a 10 a 12 RPM, em temperatura ambiente, coletando amostras a intervalos de 15 a 20 minutos, durante um total de 120 minutos, para verificar a formação de aglomerados.
Pipete 10 microlitros da amostra em uma lâmina de vidro e cubra com uma lamínula para examinar sob fluorescência. Um agregado é considerado um conjunto de três ou mais eritrócitos infectados. Este experimento analisou aproximadamente 70% de estágios maduros de p FALs parem após enriquecimento por flutuação em gel de plasma. Os agregados são facilmente identificados ao microscópio, assim como à luz normal. Eles aparecem como agregados celulares e sob fluorescência como manchas verdes ou vermelhas.
Quando coradas com acro e orange ou brometo de atherium, respectivamente. O tamanho dos agregados aumenta significativamente para uma média superior a 15 PBMCs por agregado após incubação por 120 minutos, com alguns agregados contendo numerosos PBMCs por agregado que não puderam ser contados visualmente. A frequência do fenótipo de agregação é calculada como o número de células infectadas presentes em agregados por 1000 células infectadas contadas em ensaios duplicados.
Após assistir a este vídeo, você agora deverá ter uma compreensão clara de como realizar o ensaio de agregação mediada por plaquetas de plasmodium falciparum. Tenha cuidado para não ativar as plaquetas com movimentos bruscos e variações de temperatura. Este ensaio também pode ser aplicado para medir a agregação mediada por plaquetas na malária grave.
Visão Geral
Este método investiga o fenótipo de agregação mediado por plaquetas de eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum em isolados clínicos. O procedimento envolve o isolamento e a co-incubação de plasma rico em plaquetas com uma suspensão de hemácias parasitadas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microbiologia
- Pesquisa Clínica
Antecedentes
- A agregação mediada por plaquetas é um fenômeno significativo na patologia da malária.
- Compreender essa agregação pode auxiliar na avaliação da gravidade da malária.
- Métodos padronizados são essenciais para a reprodutibilidade na pesquisa.
- Este estudo concentra-se em isolados clínicos em ambientes com poucos recursos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo padronizado para ensaios de agregação mediada por plaquetas.
- Medir o fenótipo de agregação de Plasmodium falciparum.
- Facilitar a pesquisa em regiões endêmicas de malária.
Métodos Utilizados
- Coleta de sangue de pacientes infectados e doadores saudáveis.
- Centrifugação para isolar eritrócitos parasitados e preparar plasma rico em plaquetas.
- Co-incubação de plaquetas com hemácias parasitadas.
- Avaliação da agregação utilizando microscopia de imunofluorescência.
Resultados Principais
- O fenótipo de agregação foi medido com sucesso em isolados clínicos.
- Foram identificadas condições de ativação de plaquetas para minimizar a variabilidade.
- Os resultados indicaram formação significativa de agregados após a incubação.
- O tamanho dos agregados aumentou significativamente ao longo do tempo, indicando agregação ativa.
Conclusões
- O ensaio fornece um método confiável para o estudo da patologia da malária.
- A padronização é crucial para obter resultados consistentes em diferentes ambientes.
- Este método pode ser adaptado para uso em ambientes com poucos recursos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A agregação mediada por plaquetas de eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum fornece um fenótipo mensurável associado à gravidade da malária em populações endêmicas. A padronização deste ensaio permite a avaliação consistente dos mecanismos de adesão do parasita em locais de campo com recursos limitados. Isso apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de terapias antimaláricas, ao associar fenótipos in vitro a desfechos clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de adesão hospedeiro-parasita envolvendo os receptores CD36 e gC1qR/HABP1/p32.
- Valor Operacional: Fornece um método padronizado para avaliar o fenótipo de agregação em isolados clínicos sem criopreservação.
- Valor Preditivo: Relaciona a frequência de agregação in vitro com a gravidade da doença em populações de pacientes, apoiando estudos de associação de biomarcadores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Utiliza plasma rico em plaquetas e eritrócitos parasitados purificados para gerar leituras quantitativas de agregação.
- Reprodutibilidade: Define intervalos de centrifugação, incubação e coleta de amostras para minimizar a variabilidade em ambientes com recursos limitados.
- Escalabilidade: Requer equipamentos mínimos (centrífuga, microscópio), permitindo sua implantação em diversos locais de campo endêmicos para malária.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Relaciona a agregação mediada por plaquetas aos fenótipos graves de malária observados em casos pediátricos de malária cerebral.
- Continuidade Translacional: Permite a transição de testes com isolados de campo para estudos mecanicistas da inibição de receptores de adesão.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a priorização de compostos ou anticorpos que interrompem a agregação mediada por plaquetas em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta da malária, desde a validação inicial do alvo até a avaliação pré-clínica de intervenções bloqueadoras da adesão.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações entre ligantes e receptores parasitários envolvidas na sequestro e na patologia microvascular.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas (frequência e tamanho dos agregados) para avaliar os efeitos de compostos sobre a agregação mediada por plaquetas.
- Análises: Gera pontos finais mensuráveis — frequência de agregados por 1000 células infectadas e tamanho médio dos agregados — permitindo comparações entre isolados e condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a fenotipagem in vitro com correlações clínicas ex vivo obtidas de coortes de pacientes com malária grave.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar fenótipos de adesão em diferentes cepas de Plasmodium falciparum e isolados geográficos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na sequestro de parasitas ao quantificar um fenótipo de adesão mediado por receptor.
- Valor Operacional: Garante padronização por meio de etapas definidas de preparação de plaquetas, enriquecimento de parasitas e incubação cronometrada.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper programas antimaláricos ao identificar compostos que inibem mecanismos patogênicos de adesão.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao associar a inibição de agregação in vitro à possível redução de desfechos graves de malária.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em parasitologia, manipulação de sangue e microscopia para o preparo preciso do isolado e detecção de agregados.
- Depende do acesso a centrífuga para o preparo do plasma rico em plaquetas e purificação de eritrócitos parasitados.
- Necessita padronização da velocidade de agitação (10–12 rpm) e dos intervalos de amostragem (15–20 min) entre os locais para garantir reprodutibilidade.
- Deve levar em conta a sensibilidade das plaquetas a variações de temperatura e ao estresse mecânico durante o isolamento e a montagem do ensaio.
- Limitado a leituras qualitativas e semi-quantitativas, salvo quando associado a imagem automatizada ou citometria de fluxo para adaptação de alto rendimento.
