Avaliação do Câncer de Migração Stem Cell Usando compartimentar dispositivos microfluídicos e imagens de células vivas

O objetivo geral deste procedimento é inspecionar e caracterizar visualmente a migração de células cancerígenas por meio de um dispositivo microfluídico compartimentalizado. Isso é realizado primeiramente dissociando neuroesferas pré-existentes de células-tronco tumorais cerebrais cultivadas em meio livre de soro. O segundo passo é fabricar um molde mestre de SU-8 em camada dupla e utilizar um carimbo de PDMS por litografia suave com um desenho compartimentalizado.

Em seguida, monte o dispositivo microfluídico e carregue-o com células-tronco de tumor cerebral. Por fim, a aquisição de imagens de longo prazo em lapso de tempo da migração de células-tronco de tumor cerebral é realizada utilizando um sistema microscópico integrado. Em última análise, os resultados mostram que as células-tronco de tumor cerebral exibem uma sequência contínua de estágios morfológicos durante sua migração por espaços ultraconfinados.

A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a câmara Transwell Boyton, é que o microdispositivo permite a inspeção visual do processo de migração, o posicionamento controlado de células e a entrega precisa de fatores. Portanto, a tecnologia microforça possui características de seleção e navegação celular única confiável, eficiente e com custo-benefício. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia de metástase e recorrência do câncer, pois a análise de células individuais altamente migratórias pode identificar potenciais alvos futuros para quimioterapia.

Embora este método possa fornecer informações sobre o comportamento migratório de sistemas cancerígenos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como desenvolvimento embrionário, respostas imunes, cicatrização de feridas e regeneração de órgãos. Iniciando com a suspensão celular de neuroesferas derivadas de BTSC. Reúna as células em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue-as a 900 RPM por cinco minutos, mas não mais rápido que isso.

Aspire o sobrenadante. Em seguida, permita que os neuroesferoides se soltem incubando-os em 0,5 mililitros de Accutase pré-aquecido por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, rompa mecanicamente as células com 10 a 20 movimentos suaves de uma pipeta P100.

Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio de células-tronco para neutralizar a centrifugação com Accutase, centrifugue a suspensão celular a 1300 RPM durante cinco minutos e re-suspenda as células em um mililitro de meio de células-tronco. Verifique a densidade celular com um hemocitômetro e ajuste a densidade para 20.000 células por microlitro. Para iniciar a fabricação do molde mestre SU-8, prepare duas máscaras fotolitográficas utilizando o Adobe Illustrator e filme transparente impresso a laser com Image Setter incorporado.

A máscara fotográfica da primeira camada consiste em dois marcadores fiduciais e uma matriz de microcanais, e a segunda camada da máscara fotográfica possui as câmaras de acomodação e recepção. Limpe ambas as camadas da máscara com isopropanol e deixe secar ao ar. Em seguida, aplique por centrifugação um wafer de suporte com uma camada de 3 µm de espessura de resistência fotográfica SU-8, seguida de pré-assamento.

Em seguida, com a primeira máscara fotolitográfica em contato próximo com luz UV, exponha a foto, resista e deixe curar. Depois, faça a pós-cozimento e desenvolva a pastilha curada. Cubra as áreas dos marcadores de referência da pastilha de manuseio com fita adesiva transparente.

Em seguida, aplique o fotoresiste de 250 mícrons de espessura sobre a pastilha por meio de spin coating. Depois, remova a fita para expor os marcadores destinados ao alinhamento. Aplique a segunda camada de fotoresiste e alinhe os marcadores fiduciais.

Em seguida, exponha à UV e cure a máscara fotolitográfica da segunda camada, seguido de pré-assamento e revelação. Agora, silanize o molde de SU-8 por deposição em fase vapor para reduzir a aderência superficial. Coloque as pastilhas em um dessecador com várias gotas de solução de triclorosilano sob vácuo por pelo menos uma hora.

O molde mestre estará então pronto para uso na moldagem de PDMS. Comece misturando completamente a base do pré-polímero com o agente de cura numa proporção de 10 para 1. Em seguida, coloque a mistura em um dessecador para desgaseificação a vácuo até que nenhuma bolha de ar seja visível.

Despeje a mistura sobre a máscara e desgaseifique novamente. Se novas bolhas de ar forem introduzidas, cure o molde em uma placa aquecedora nivelada por duas horas a 90 graus Celsius. Após esfriar até a temperatura ambiente, remova cuidadosamente o carimbo de PDMS.

Assim, os canais de cultivo são gravados em PDMS e estão prontos para a montagem do dispositivo microfluídico. O molde mestre pode ser reutilizado para moldagem até que se quebre ou desgaste. Quando o molde mestre ficar pegajoso, o revestimento antiaderente pode ser reaplicado.

Inicie criando entradas e saídas no dispositivo microfluídico através do carimbo de PDMS. Usando uma punção de biópsia, limpe o carimbo de PDMS mergulhando-o em etanol 70% por 30 minutos e, em seguida, enxaguando-o com água desionizada por 10 minutos. Esterilize e complete as reações de reticulação do carimbo de PDMS por autoclavagem.

Agora, coloque o carimbo de PDMS sobre uma lamínula de vidro revestida com poli-L-lisina. Em seguida, o dispositivo é revestido com laminina preenchendo as câmaras com solução de laminina por meio das entradas dos reservatórios e incubado durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, aspire a laminina do dispositivo.

Em seguida, lave o dispositivo inundando-o duas vezes com meio de células-tronco. Agora, carregue 11 microlitros de células dissociadas em um dos reservatórios de semeadura. Se necessário, use aspiração a vácuo para forçar as células para dentro da câmara. Em seguida, carregue mais sete microlitros de células no reservatório de acomodação adjacente.

Após cinco minutos, os reservatórios de assentamento e recepção estarão cheios de meio. Agora, coloque uma folha estéril de PDMS com espessura de 0,5 a um milímetro sobre o dispositivo. A adesão superficial natural do PDMS a si mesmo selará o dispositivo; uma vez selado, ele estará pronto para transporte, incubação e imageamento microscópico.

Pré-equilibre o biot, IM, operando-o durante 45 minutos. Para estabilizar sua temperatura, umidade e suprimento de ar, adicione várias placas com água à câmara de amostra para obter a umidade adequada. Carregue o dispositivo preparado na câmara de amostra do microscópio.

Centralize o dispositivo usando pinças microscópicas. Agora defina os pontos de foco e os pontos de tempo usando o software Biot e inicie as gravações com lapso de tempo, se necessário. Após cinco dias em cultura, substitua o meio de cultura.

Os BTCs semeados no dispositivo foram continuamente registrados por imagem de contraste de fase. Durante cinco dias na câmara de assentamento, células em forma de fuso permaneceram na fase pré-migração. À medida que se aproximavam da entrada do microcanal, algumas células se expandiram e geraram protrusões adesivas.

Apenas uma célula conseguiu ocupar a entrada e explorar a direção da migração. Uma vez que a célula determinou a direção da migração, prosseguiu percorrendo todo o microcanal em alta velocidade constante. Ao final do microcanal, a célula passou a explorar o espaço aberto da câmara receptora antes de finalmente ingressar nela.

Ao observar as células com intervalos de imagem de dois segundos, a potência migratória pareceu ser gerada principalmente por atividade de borbulhamento, semelhante à de células OID. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar que o design do dispositivo é tão flexível que as dimensões dos microcanais podem ser manipuladas para alcançar um grau desejado de migração celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um dispositivo microfluídico compartimentalizado exclusivo, adequado para o cultivo de suas células de interesse, e então realizar imagens de lapso de tempo de longo prazo para definir qualitativa e quantitativamente as características migratórias dessas células seguindo este procedimento.

Outros métodos, como o sequenciamento de nova geração ou microarranjos de DNA, podem ser aplicados para responder perguntas adicionais, como quão geneticamente diferentes são as células cancerígenas altamente migratórias.