Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar células positivas para LAX Z do cóclea de camundongo neonatal utilizando citometria de fluxo. Isso é alcançado primeiramente isolando um grande número de cócleas de camundongo em um período de tempo relativamente curto, para manter as células viáveis e obter tecido inicial adequado. Como segundo passo, as células positivas para LAX Z são dissociadas e então marcadas para preparar o tecido para separação.

As células são então separadas por citometria de fluxo. As populações resultantes de LAX Z alto e lax baixo podem então ser utilizadas para experimentações adicionais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa auditiva, como quais são os perfis genéticos ou populações celulares específicas dentro da orelha interna.

Quem demonstrará o procedimento será Taha Gen, um estudante de medicina do nosso laboratório. Primeiro, preencha placas de Petri de 35 milímetros com HBSS e coloque-as sobre um bloco de gelo. Em seguida, após usar tesoura de íris para decapitar de 12 a 15 camundongos eutanasiados, com idade pós-natal de zero a três dias, portadores do repórter axon e camundongos selvagens.

Coloque as cabeças em uma placa de Petri de 60 milímetros sobre um bloco de gelo. Em seguida, use pinça número cinco Dumont e tesoura de íris para remover a mandíbula e a língua das cabeças, e depois corte a base do crânio ao nível do palato. Agora, remova a pele sobrejacente do crânio e seccione a base do crânio inserindo a tesoura na parte inferior do forame magno até o meio do palato.

Realize outro corte com a tesoura da borda cortada do palato até a região superior do cálcaneo em ambos os lados, tomando cuidado para não danificar a cápsula ótica. Em seguida, finalize o isolamento do osso temporal realizando dois cortes angulados a 45 graus, iniciando na região superior da estrutura e do magno, estendendo-se até o corte coronal no palato duro.

Em seguida, coloque os ossos temporais isolados nas placas de Petri de 35 milímetros contendo HBSS sobre o bloco de gelo e transfira o bloco de gelo para uma câmara de dissecação estéril. A seguir, encha outra placa de Petri de 35 milímetros, desta vez com PBS, e coloque-a sobre o bloco de gelo. Usando duas pinças número 55.

Inicie a microdiseção removendo suavemente o córtex, o bulbo e o cerebelo do osso temporal que recobre a cápsula ótica. Em seguida, sem remover a cápsula ótica, retire partes da cápsula coclear começando pela entrada do nervo vestibulococlear e continuando em direção à cápsula ótica. Após a exposição da base da cóclea, puxe suavemente o órgão de Corti e os tecidos circundantes.

Em seguida, começando pela base, remova qualquer gânglio espiral e estria vascular remanescentes e transfira a cóclea para a placa de Petri contendo PBS. Pipete 50 microlitros de PBS estéril no centro de uma a duas cavidades de uma placa de cultura de seis poços não revestida. Em seguida, transfira no máximo 20 axônios de duas cócleas para cada gota de PBS.

A seguir, aqueça previamente alíquotas de 50 microlitros de tripsina 0,125% por cerca de dois minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione a tripsina à cóclea, tomando cuidado para não agitar o recipiente.

Incube a cóclea a 37 graus Celsius por oito minutos. Interrompa a tripsinização adicionando 50 microlitros de inibidor de tripsina de soja a cada gota e, em seguida, adicione mais 50 microlitros de meio completo após ajustar uma pipeta P200 para 125 microlitros. Use uma ponteira de pipeta romba de 300 microlitros para pipetar suavemente as células 80 vezes, tomando cuidado para não formar bolhas.

Em seguida, após cada gota ter sido triturada, adicione mais 200 microlitros de meio completo a cada uma. Agora, passe as células através de um filtro celular de 40 mícrons para um novo poço. Na mesma placa de seis poços e, em seguida, transfira as células de cada poço para tubos cónicos individuais padrão.

Em seguida, adicione 100 microlitros de células selvagens a cada um dos três tubos, seguido pela diluição com 300 microlitros de meio completo apenas para o CUG. Como controle, dilua 10 microlitros de axón, duas células LAX Z, em 390 microlitros de meio completo. Transfira as células axón duas LAX Z restantes para tubos de fax em 400 microlitros de OTs.

Em seguida, após incubar os tubos em um incubador umidificado a 37 graus Celsius por 10 minutos, adicione 200 microlitros de CUG diluído a cada tubo fax apropriado. Depois, protegendo todos os tubos da luz, incube as células em um incubador umidificado a 37 graus Celsius por 25 minutos. Para a coloração, enquanto as células estão em incubação, coloque 10 mililitros de heaps recém-preparado mais FBS em um tubo de 15 mililitros e coloque o tubo no gelo.

Em seguida, adicione 1,8 mililitro da solução gelada de heap a cada um dos tubos de fax sob a capela estéril com as luzes apagadas para minimizar a exposição à luz. A seguir, centrifugue as células a 1200 RPM durante cinco minutos à temperatura ambiente. Então, remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 300 microlitros de meio completo.

Reúna todas as alíquotas da amostra para classificação e, em seguida, adicione iodeto de propídio a cada tubo apropriado até atingir uma concentração final de um micrograma por mililitro. Por fim, após cobrir as células novamente, coloque-as no gelo. Configure os limites de classificação coletando inicialmente 1000 eventos das células selvagens não coradas para determinar a distribuição celular no gráfico de dispersão para frente versus dispersão lateral.

Ajuste os parâmetros de dispersão para a frente e lateral conforme necessário. Em seguida, faça a compensação com o tipo selvagem não corado, o tipo selvagem corado com PI e o axônio corado com CUG. Duas células LAX Z.

Encha dois tubos FACS com 500 microlitros de meio completo. Em seguida, inicie a análise com as células selvagens coradas com PI e as células axon duas coradas com Lae CUG, utilizando o gate para excluir detritos com base no gráfico de dispersão frente versus dispersão lateral. Exclua dupletos e agregados utilizando o gráfico de altura de dispersão frente versus área de dispersão frente.

Em seguida, exclua as células mortas positivas para PI com base no gráfico de área de dispersão para frente versus área PE sci cinco. Para cada posição de comporta, configure um gráfico de área de dispersão para frente versus área cascade ou azul Pacífico. Analise 10.000 eventos do tubo de amostra de ordenação contendo células coradas com axon dois laxy PI e CUG utilizando todas as comportas definidas com as células do tipo selvagem, com base nos gráficos obtidos das células do tipo selvagem.

Crie portas para as células com alta intensidade de azul em cascata que representem menos de 1% do número total de eventos. As portas de alta intensidade de azul em cascata devem agora conter cerca de 15 a 20% das células na amostra Axon dois laxy. Usando essas células Axon dois positivas, com base no gráfico de análise de células Axon dois laxy, crie agora uma porta para as células com menor fluorescência, abrangendo 15 a 20% das células, utilizando a estratégia de porteamento acima mencionada.

Seccione as células nos tubos de fax que contêm meio completo, mantendo os tubos de coleta em uma câmara resfriada a quatro graus Celsius durante a separação. Registre o número de células contadas pelo citômetro de fluxo para cada população nestas duas figuras. As áreas de dispersão lateral versus as áreas de dispersão frontal do tipo selvagem dissociado à esquerda e do axon dois LA Z à direita.

As células cocleares são mostradas. Observe o comportamento dos grupos distintos de eventos de tamanho muito maior do que aqueles eventos mais próximos ao eixo Y, designados como população negativa para detritos. Típicamente, de 40 a 45% das células livres de detritos são recuperadas tanto da cóclea de tipo selvagem quanto da axin dois LAX Z nestes dois painéis.

A altura do espalhamento para a frente versus a área do espalhamento para a frente é utilizada para excluir dupletos dos detritos previamente selecionados. Eventos de populações negativas que se desviam da natureza linear esperada do gráfico são excluídos. Este preparo normalmente resulta em 71,1% dos eventos dentro do quadrante designado. Aqui.

O iodeto de propídio, detectado pelo canal PE SCI de cinco canais, é utilizado para excluir células mortas, conforme observado nestes diagramas de dispersão. Cerca de 95% das células classificadas eram viáveis e não absorveram PI nos painéis apresentados. O canal Cascade blue foi utilizado para detectar o substrato fluorescente CUG, conforme visto na figura à direita.

Em média, as células positivas para CUG no topo, cerca de 20%, são células lae altas que correspondem a aproximadamente 15.000 axónios, duas células altas a cada 10 a 12 animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e isolar células lae altas utilizando citometria de fluxo a partir de tecidos da orelha interna, tanto para experimentos de Turing celular quanto para experimentos como perfis gênicos.