RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans

O objetivo deste procedimento é identificar reguladores pós-embrionários da expressão e localização de proteínas em C. elegans utilizando uma triagem genômica baseada em RNAi e proteínas marcadas com fluorescência. Uma vez que a linhagem apropriada para triagem é construída, uma biblioteca de RNAi é escolhida. O primeiro passo do procedimento é empacotar os clones da biblioteca em bactérias.

As bactérias são então selecionadas, cultivadas e fornecidas como alimento a nematoides C. elegans em estágios definidos. Após permitir que os nematoides cresçam por 72 horas, eles são observados quanto a alterações no fenótipo de interesse. Em última instância, alterações na expressão ou na localização subcelular da proteína alvo são visualizadas por microscopia de fluorescência.

Este método pode identificar genes necessários para a correta localização subcelular de uma proteína marcada com fluorescência. No entanto, este protocolo pode ser modificado para identificar genes que afetam outros fenótipos pós-embrionários de interesse. A principal vantagem desta técnica em relação aos protocolos publicados existentes é que otimizamos a consistência e o nível da resposta de RNAi em animais mediante a indução da produção de RNA de fita dupla em bactérias antes do plaqueamento.

Realizando o procedimento, estará Kathy Fuss, uma pesquisadora associada do meu laboratório. Dentro de dois meses a partir do início do experimento, prepare a biblioteca de clones primeiro estriando bactérias a partir de clones selecionados da biblioteca de alimentação, bem como controles positivo e negativo em placas de LB com tetraciclina. Como controle positivo, utilize um clone contendo um gene que produz um fenótipo pós-embrionário dependente da dose, tal como BLE quatro. Como controle negativo, utilize um vetor vazio ou um clone contendo um pseudogene previsto sem fenótipos observados.

Incube as placas durante a noite; para cada clone, inocular dois mililitros de meio LB contendo 50 microgramas por mililitro de ácido carbônico a partir de uma única colônia das placas de esgotamento. Incube os cultivos durante a noite com agitação. Na manhã seguinte, as soluções devem estar turvas; induza a produção de RNA de fita dupla adicionando IPTG aos cultivos e incube-os por mais quatro a cinco horas nas mesmas condições.

A adição de IPTG garante uma redução mais consistente e robusta do produto gênico induzida por RNAi do que depender apenas do IPTG e do agente indutor da placa NGM. Após a incubação com IPTG, aplique 30 microlitros de cultura de cada clone em cada poço das placas NGM de RNAi preparadas de 24 poços. Um clone por poço. Cada placa deve ter dois poços destinados aos controles.

Marque cuidadosamente a localização de cada biblioteca. Incube os clones nas placas de 24 poços e agora coloque as placas descobertas em uma câmara de fluxo estéril para secar por cerca de 20 minutos. Não permita que as bordas do ágar se soltem da placa.

Uma vez secos os nematoides em estágios determinados nas placas, são fornecidas instruções sobre o preparo dos nematoides. Na próxima seção, inicie com uma população em estágio determinado de nematoides na primeira fase larval ou L1. Começar com larvas L1 evita possíveis fenótipos letais embriônicos.

Ter uma população de animais em estágios definidos para triagem também aumenta a confiança de que quaisquer variações observadas são devidas ao RNAi e não simplesmente variações normais que ocorrem em diferentes estágios. No entanto, se o RNAi causar um atraso no desenvolvimento, isso deve ser observado pelo triador Bleach. Uma população de estágios mistos da linhagem utilizada na triagem.

Apenas embriões com casca de ovo protegida sobreviverão a esta etapa, estagiando os animais com precisão de 12 horas se realizada a 20 graus Celsius ou com precisão de 18 horas se realizada a 16 graus Celsius no dia em que as culturas bacterianas são inoculadas. Selecione três placas de 100 milímetros de animais da linhagem de triagem que estejam saudáveis e contenham tanto larvas, adultos quanto embriões.

Lave todos os animais em meio M nove estéril e transfira a lavagem para um tubo estéril de 15 mililitros com tampa de rosca. Se a lavagem for maior que 3,5 mililitros, centrifugue os animais e remova todo o líquido, exceto 3,5 mililitros. Se for menor que 3,5 mililitros.

Aumente o volume para 3,5 mililitros com água ou M nove para liberar os embriões dos adultos em 1,5 mililitros de uma mistura de hidróxido de sódio e hipoclorito a cada lavagem. Deixe os animais incubarem por não mais de 10 minutos nesta solução. Após iniciar um cronômetro, vortexe cada tubo por 10 segundos e repita a vortexação a cada dois minutos.

Após cada vortexação, observe a solução ao microscópio estereoscópico em busca de cadáveres de animais. Dentro de seis a oito minutos, os adultos estarão fragmentados e os embriões deverão ser liberados. Remova os embriões da solução de hipoclorito por centrifugação e remova o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o pellet.

Em seguida, ressuspenda o pellet em um volume de 10 mililitros adicionando M nove estéril e utilizando agitação. Repita este processo de lavagem pelo menos mais uma vez até que o cheiro de hipoclorito seja completamente indetectável. Para estagiar mais precisamente os animais, detenha-os no estágio L um fazendo os embriões eclodirem em meio M nove sem alimento.

Isso é feito transferindo os embriões em M nove para um pequeno frasco erlenmeyer. Agite o frasco durante a noite na temperatura adequada para a linhagem e o experimento. Nesse período, os animais irão eclodir e sofrer arresto na diapausa L um no dia seguinte.

Retome o crescimento das larvas a partir de um ponto de tempo determinado transferindo-as para as bactérias preparadas que expressam RNA de fita dupla. Este é o mesmo dia em que as placas de 24 poços foram inoculadas com bactérias. Comece transferindo os animais L1 para um tubo de 15 mililitros e centrifugando-os. Em seguida, concentre os animais em meio a um mililitro de M9 e coloque cinco microlitros dos nematoides concentrados em uma placa.

Conte o número de animais na placa e ajuste a solução concentrada de nematoides. TE 30 vermes para cada três a 10 microlitros. Por fim, aplique aproximadamente 30 L de animais de um mesmo estágio sobre as bactérias em cada poço da placa preparada.

Em uma placa de 24 poços, mais de 30 animais por poço pode resultar em desnutrição. Após as gotas secarem, o que levará alguns minutos, fixe a tampa com o elástico, incube os animais invertidos na temperatura e duração necessárias para analisar os animais no estágio desejado. Assim que os nematoides estiverem prontos para triagem, confirme que os controles positivo e negativo produzam os fenótipos esperados. Em seguida, observe os animais experimentais quanto a anormalidades no desenvolvimento.

Em seguida, utilizando um microscópio estereoscópico, monte oito a 12 animais de cada poço em lâminas de Agri PET 4% com uma gota de cinco microlitros de anestésico. Após aplicar a lamínula apropriada, realize observações de pelo menos cinco animais utilizando microscopia composta. Mantenha um banco de dados organizado com o gene, o número de animais observados e os resultados fenotípicos.

Para cada experimento de RNAi, verifique qualquer fenótipo produzido pelo RNAi de R por meio de um segundo fenótipo, se possível, e repetindo o experimento; experimentos repetidos podem utilizar bactérias da mesma estria. Estrias mais antigas podem resultar em crescimento deficiente em culturas líquidas noturnas e devem ser reestriadas primeiramente. Algumas culturas bacterianas não crescerão bem devido ao produto gênico expresso em seu plasmídeo.

Neste caso, basta concentrar as bactérias antes da semeadura. Para uma triagem contínua, é importante manter sempre muitos embriões prontos para estadiamento. A linhagem de triagem deve sempre ser alimentada, não privada de alimento, e livre de contaminantes que possam afetar o fenótipo de interesse.

Estabelecemos um cronograma de manutenção para alimentar os animais. Genes que afetam a localização de DBL um foram identificados por RNAi utilizando uma linhagem projetada para esta triagem. A expressão normal da marcação GFP em dbl um inclui corpos celulares da corda nervosa ventral e uma fileira de pontos em animais alimentados com AR antissenso para DBL.

Um mRNA apresentou expressão severamente atenuada da DBL um. Esses animais também eram pequenos, semelhantes aos animais que carecem de DBL L um funcional. A triagem de RNA I identificou com sucesso muitos outros genes cujos produtos afetam a localização da DBL um, expandindo assim nossa compreensão de como o TGF beta é transportado ao nível subcelular e fornecendo um ponto de partida para muitas outras investigações.

Usando este método, uma única pessoa pode razoavelmente montar e observar dois a quatro conjuntos de experimentos por semana. Por exemplo, animais montados na segunda e terça-feira podem ser observados na quinta e sexta-feira, respectivamente, e novos animais podem ser montados novamente na sexta-feira e sábado para observação na segunda e terça-feira. Observação ao seguir este procedimento durante toda a sua triagem.

É importante manter muitos embriões prontos para estadiamento, portanto, mantenha regularmente a linhagem de triagem. Além disso, é fundamental anotar detalhadamente todas as observações.