Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as características físicas básicas das amostras celulares, incluindo massa e volume, com um microscópio óptico padrão e processamento de imagem. Isso é feito pela primeira montagem de amostras celulares cultivadas em lamínulas de vidro em lâminas de microscópio. Em seguida, através do foco, são obtidas imagens de contraste, campo claro e interferência diferencial.

Em seguida, cada pilha Z de imagens é inserida em programas de processamento de imagem MATLAB separados que extraem os dados físicos. Em última análise, as propriedades físicas básicas dos espécimes celulares são obtidas por meio de medições de intensidade de foco, sob contraste de campo claro e microscopia de contraste de interferência diferencial. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia de fluorescência, é que as amostras celulares não precisam ser fixadas, permeadas ou coradas.

Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como como a densidade subcelular é organizada durante o ciclo celular ou entre diferentes populações de células que contribuem para um estado de doença Usando um microscópio com recursos DIC e de campo claro e especificações adicionais de acordo com o protocolo de texto, comece abrindo o software do livro de slides e criando um novo slide para coleta de imagens. Em seguida, abra a janela de foco e, na seção do conjunto de filtros, selecione DIC Na guia do osciloscópio, na seção do condensador, ajuste a barra deslizante de abertura para a posição mais à direita. Isso fornece iluminação de alta abertura numérica e melhora o seccionamento óptico da amostra.

Depois de capturar uma pilha DIC do exemplo, abra a janela de foco e selecione abrir. Na seção do conjunto de filtros, ajuste a barra deslizante de abertura para a posição mais à esquerda totalmente fechada para fornecer baixa iluminação NA. Após o ajuste da intensidade do sinal, abra a janela de captura de imagem.

As configurações de captura 3D da aquisição da pilha DICZ serão exibidas na seção do conjunto de filtros da janela de captura de imagem. Marque a caixa aberta e especifique o tempo de exposição. Na seção de informações da imagem, nomeie a imagem e selecione iniciar para iniciar a aquisição de imagem Zack.

Em seguida, exporte as pilhas Z de acordo com o protocolo de texto para realizar medições de volume uma vez no programa H-T-D-I-C MATLAB intitulado JoVE HT DCO V one M Na seção zero, atualize a variável de diretório de dependências copiando e colando o diretório que contém o hilbert. Transforme arquivos DM e sobel edge Detect M do explorer. Entre as aspas simples seguindo o diretório de dependências é igual a execute a seção zero do programa joco HT DCO V one M.

Na seção um, atualize o diretório de imagens copiando e colando o diretório que contém as imagens de foco direto no formato TIF. Entre as aspas simples, execute esta seção apenas uma vez para alinhar e girar as imagens. Para a transformação de hilbert, execute a seção dois do código Uma caixa de diálogo intitulada Definir parâmetros HT DIC aparecerá.

Em seguida, insira o número do plano focal onde a imagem DIC da amostra está em foco, a resolução lateral, a resolução axial, o ângulo de rotação da imagem DIC necessária para realizar a transformada de hilbert e, por último, o tamanho da região de interesse. Em seguida, clique em OK. Uma imagem do plano focal DIC especificado pelo número do plano focal aparecerá com uma caixa azul.

Posicione a caixa sobre o recurso de interesse, como uma célula. Uma vez que a caixa tenha sido posicionada sobre a região desejada, clique duas vezes dentro do B.O contraste da imagem deve ser tal que os recursos escuros apareçam à esquerda enquanto os recursos claros apareçam à direita. Arraste a caixa azul sobre a região de interesse e remodele conforme necessário.

Em seguida, na seção três, para gerar uma máscara retangular, un linha de comentário 1 6 7 e linha de comentário 1 7 0 execute a seção três do programa clicando na imagem e arrastando o mouse para começar a definir a máscara retangular. Em seguida, clique duas vezes na caixa para aceitá-lo. Para gerar uma máscara desenhada à mão, comente a linha 1 6 7 e un linha de comentário 1 7 0 antes de executar a seção três Ao clicar e desenhar a máscara desejada com o mouse, clique duas vezes na máscara para aceitá-la após executar a seção quatro, para construir pilhas de imagens transformadas de hilbert de acordo com o protocolo de texto executa a seção cinco.

Otimizar a segmentação das imagens transversais xz da região de interesse. A Figura 500 produzida pelo programa aparece exibindo três tipos diferentes de contraste. O sucesso do algoritmo para encontrar as bordas da célula depende de uma combinação da máscara usada e do valor do limite na linha 2, 2, 9 do programa, comece com um valor de 0,5 e ajuste o valor do limite e execute novamente esta seção do programa até que o contorno adequado seja alcançado em uma das colunas.

Se o contorno foi melhor na coluna um, na segmentação DIC, use a seção seis para determinar o volume. Se a coluna dois deu resultados ideais, execute a seção sete para determinar o volume da célula de hilbert, transforme as imagens DIC Se a coluna três deu os resultados ideais, use as imagens DIC de transformada de hilbert filtradas enquanto executa a seção oito para determinar o volume para fazer medições de massa no programa NIQ PM MATLAB e intitulado JO VCO NI qpm V1 M Sob a seção zero. Atualize a localização das dependências dos três diretórios, BRIGHTFIELD e diretório DIC após executar a seção um, execute a seção dois na caixa de diálogo intitulada definir parâmetros N-I-Q-P-M insira o número do plano focal onde a imagem de campo claro da amostra está em foco, a resolução lateral, a resolução axial e o tamanho da região de interesse.

Em seguida, clique em OK. Uma imagem do plano focal de campo claro especificado pelo número do plano focal aparecerá com uma caixa azul. Depois de ajustar o foco, se necessário, executando novamente a seção dois, arraste a caixa ao redor da imagem e selecione os nós da caixa e arraste-a para redimensioná-la antes de clicar duas vezes dentro da caixa para aceitá-la.

Uma vez que uma pilha de imagens de campo claro tenha sido construída executando a seção três, execute a seção quatro para gerar o mapa de fase, imagens pseudo DIC e comparações com imagens de campo claro e a imagem DIC verdadeira quando as imagens pseudo DIC e DIC verdadeiras forem o mais semelhantes possível, execute a seção cinco A ou cinco B que permite ao usuário delinear a célula para gerar o mapa de densidade de massa, A massa total e o histograma da densidade celular estão corretos. A iluminação da amostra durante a aquisição de imagens de foco é fundamental para a implementação bem-sucedida do algoritmo N-I-Q-P-M e HTDIC. Esta figura ilustra a iluminação baixa e alta de NA sob DIC e contraste de campo claro para uma esfera de poliestireno e a linha celular de adenocarcinoma colorretal humano SW seis 20.

Esses painéis demonstram imagens ideais para N-I-Q-P-M e exibem imagens ideais para HT DIC. Essas imagens demonstram a dependência de parâmetros do algoritmo NIQ PM, destacando implementações bem-sucedidas e malsucedidas. Aqui, exploramos o perfil de fase de uma esfera de poliestireno de 4,8 micrômetros de diâmetro.

O perfil esperado é conhecido teoricamente e, portanto, pode ser comparado diretamente à reconstrução do NIQ PM. Esses painéis apresentam a melhor reconstrução possível para os efeitos de difração da esfera em ambos os limites da esfera e no interior, evitando a reconstrução estável em todos os pontos da esfera. A região central da esfera pode ser capturada com N-I-Q-P-M com um erro percentual de um a 5%, como visto em espécimes celulares do Painel L cujas propriedades de fase não são conhecidas.

A priori pode ser reconstruído usando NIQ PMM em conjunto com um procedimento para comparar uma imagem pseudo DIC com uma imagem DIC real. N-I-Q-P-M tem um parâmetro livre. O plano na pilha de imagens do campo direito no qual o cálculo é centralizado.

Este plano focal central deve ser ajustado até que as imagens pseudo DIC e DIC verdadeira pareçam o mais semelhantes possível. Apresentamos aqui uma imagem pseudo DIC fora de foco, uma imagem pseudo DIC ideal e a imagem DIC correspondente da célula tirada com uma iluminação NA de 0,9. Curiosamente, o melhor mapa de fase e a imagem pseudo DIC correspondente não correspondem necessariamente a uma imagem de campo brilhante em foco, conforme mostrado nesses painéis.

Por fim, aqui estão as etapas envolvidas no algoritmo de processamento de imagem HTDIC do DIC por meio de imagens de foco sob iluminação NA igual a 0,9, a transformada de hilbert é realizada para remover o relevo de base das imagens DIC. Isso vem com algum desfoque ao longo do eixo óptico que pode ser removido da filtragem passa-alta para a filtragem. Essas imagens finais são facilmente segmentadas para determinar a área em cada plano de seção transversal do espécime para inferir o volume celular total.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar a iluminação correta para imagens de contraste diferencial de minério de campo claro após este procedimento. Outros métodos, como microscopia de fluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais usando a colocalização da força do piso com mapas de densidade da amostra.