A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

O objetivo geral do experimento a seguir é converter um ensaio Eliza previamente otimizado para a citocina TNF alfa para a plataforma Xap, ao mesmo tempo em que avalia pares alternativos de anticorpos. Isso é realizado acoplando o anticorpo de captura do kit ELIZA, juntamente com outros três anticorpos de captura candidatos, a quatro conjuntos diferentes de microesferas ou partículas quando misturados. Esses quatro conjuntos permitem o teste simultâneo de todos os quatro candidatos com quatro anticorpos de detecção separados, a fim de determinar o melhor par de anticorpos.

Os dois próximos ensaios Xap são montados com os dois pares de anticorpos mais otimizados. O desempenho dos ensaios é então comparado ao do ensaio EISA original quanto à intensidade do sinal, faixa dinâmica e sensibilidade. Os resultados mostram que anticorpos semelhantes podem apresentar desempenhos muito diferentes sob as mesmas condições e que diversos anticorpos podem ser triados simultaneamente utilizando o ensaio Luminex Xap, revelando que este possui maior sensibilidade e faixa dinâmica em comparação ao EISA.

A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a EIS A, é que os imunossenzados baseados em xap permitem ao pesquisador testar múltiplos alvos, ou como neste caso, testar múltiplos anticorpos simultaneamente. Para identificar o melhor anticorpo demonstrado. O procedimento será realizado por Erica Lopez, cientista associada da Luminex Corporation.

Inicie este protocolo com a seleção e preparação de quatro anticorpos de captura e quatro anticorpos de detecção específicos para a proteína humana TNF alfa, conforme descrito no protocolo escrito. Além disso, prepare um anticorpo de confirmação específico para a espécie hospedeira dos anticorpos de captura. Leve os reagentes do kit de acoplamento de anticorpos à temperatura ambiente.

Rotule quatro tubos de reação com os números das regiões das microesferas selecionadas para a reação de acoplamento. Transfira o conteúdo dos quatro frascos de microesferas magnéticas para os quatro tubos de reação rotulados. Lave cada conjunto de microesferas duas vezes com 500 microlitros de tampão de ativação e ative cada conjunto de microesferas com as soluções de sulfo ONHS e EDC conforme descrito no kit de acoplamento de anticorpos.

Manual do usuário: após uma incubação de 20 minutos em um agitador rotativo, repita o passo anterior de lavagem com as esferas agora ativadas, um total de três vezes, com 500 microlitros de tampão de ativação. Para cada lavagem, prepare quatro soluções separadas de 500 microlitros, cada uma contendo 7,5 microgramas de anticorpo de captura no tampão de inativação.

Adicione estas quatro soluções de anticorpos de captura aos respectivos tubos de reação. Vortexe imediatamente cada tubo e incube por duas horas em um rotator. Repita o passo de lavagem com as perlas agora conjugadas um total de três vezes com 500 microlitros do tampão de lavagem fornecido com o kit de conjugação de anticorpos.

Após a etapa final de lavagem, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem a cada tubo de reação para fornecer uma concentração final de estoque de 5 milhões de microesferas conjugadas com anticorpo por mililitro, vórtex, e então sonique os tubos de reação para dispersar as microesferas. Conte o número de microesferas recuperadas após a reação de conjugação utilizando um contador de células ou hemocitômetro. A recuperação da reação de conjugação é tipicamente superior a 90%. Confirme que a reação de conjugação foi bem-sucedida preparando soluções-teste dos estoques de microesferas conjugadas para cada conjunto, com uma concentração final de 100 microesferas por microlitro em tampão de ensaio, e prepare uma diluição da espécie anticorpo marcada com FICO eritingo.

Anticorpo de confirmação de IgG a quatro microgramas por mililitro em tampão do ensaio. Aliquotar 50 microlitros de cada solução-teste em quatro poços de uma placa de 96 poços com fundo redondo, totalizando 16 poços. Em seguida, adicionar 50 microlitros de tampão do ensaio em oito dos poços para medir o fundo e 50 microlitros do anticorpo de confirmação diluído nos oito poços restantes. Misturar suavemente as reações pipetando para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta multicanal.

Cubra a placa e incube por 30 minutos em temperatura ambiente em um agitador de placa. Coloque a placa em um separador magnético por um a dois minutos para atrair as esferas para fora da solução. Em seguida, remova o líquido invertendo com força a placa enquanto estiver no separador, sobre um recipiente de resíduos.

Lave cada poço duas vezes adicionando 100 microlitros de tampão de ensaio e removendo o SANE da placa de maneira semelhante. Usando o separador magnético de placas, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão de ensaio pipetando suavemente para cima e para baixo cinco vezes com um pipetador multicanal. Analise no instrumento Luminex xap, como o instrumento Magix.

A intensidade do sinal fluorescente dessa reação é diretamente proporcional à quantidade de proteína na superfície das microesferas, fornecendo uma avaliação rápida da quantidade relativa de proteína conjugada às microesferas. Para determinar o par de anticorpos mais eficaz no ensaio xap, prepare uma mistura inicial com os quatro conjuntos de microesferas, adicionando 10 microlitros de cada um a 0,96 mililitros de tampão de ensaio. Prepare as soluções de anticorpo de detecção diluindo cada anticorpo a um micrograma por mililitro em tampão de ensaio.

Também um tampão de ensaio. Prepare o padrão de proteína TNF alfa dos sistemas r e d em 2000 picogramas por mililitro e dilua a estreptavidina R FICO eryn até oito microgramas por mililitro. Adicione 50 microlitros da mistura de anticorpos acoplados a microesferas a cada um dos 16 poços de uma placa de 96 poços com fundo redondo da CoStar para o ensaio de triagem.

Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão do ensaio a oito das 16 poças para medir o fundo. Em seguida, pipete 50 microlitros do padrão de TNF alfa nas outras oito poças para medir a resposta. Incube durante uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz, sob agitação em um agitador para placas de ensaio.

Em seguida, adicione 50 microlitros de cada um dos quatro anticorpos de detecção a quatro poços, dos quais dois são poços de fundo e dois são poços de resposta. Incube por 30 minutos nas mesmas condições após a adição de 50 microlitros do reagente SAPE a todos os poços. Incube novamente por 15 minutos nas mesmas condições.

Coloque a placa em um separador magnético por um minuto. Em seguida, remova o líquido invertendo com força a placa enquanto estiver sobre o separador, acima de um recipiente de resíduos. Pipete 100 microlitros de tampão de ensaio para cada uma das 16 poças.

Em seguida, remova o líquido das microesferas utilizando separação magnética. Depois, adicione 100 microlitros de tampão de ensaio a cada uma das 16 poças. Leitura da placa com o instrumento Luminex mag picks, consultando o manual do usuário para operação adequada.

Selecione um par de anticorpos que atenda à intensidade de sinal desejada. Após selecionar o melhor anticorpo para captura, dilua 100 microlitros da solução estoque de anticorpos conjugados em 10 mililitros de tampão de ensaio. Adicione 50 microlitros das microesferas diluídas em 78 poços de duas placas de 96 poços, fundo redondo, da CoStar.

Cada placa será usada para avaliar o desempenho de um anticorpo de detecção diferente. Em seguida, prepare uma curva padrão de 12 pontos iniciando em 8.000 picogramas por mililitro e terminando em quatro picogramas por mililitro. Com os sistemas r e d.

Adicione seis réplicas de 50 microlitros de cada diluição do padrão de TNF alfa a cada uma das placas, além de seis poços com 50 microlitros de tampão do ensaio cada, como fundo, totalizando 78 poços por placa. Incube as placas por uma hora à temperatura ambiente, protegidas da luz, sob agitação em um agitador para placas de ensaio. Em seguida, adicione 50 microlitros do primeiro anticorpo de detecção a todos os 78 poços da primeira placa.

Repita para o segundo anticorpo de detecção na segunda placa. Incube as placas por 30 minutos nas mesmas condições. Em seguida, adicione 50 microlitros do reagente SAPE a todas as cavidades de cada placa.

Após agitar as duas placas por 15 minutos protegidas da luz, coloque as placas sobre separadores magnéticos por um minuto. Remova o líquido invertendo com força a placa sobre o separador acima de um recipiente de resíduos. Em seguida, pipete 100 microlitros de tampão de ensaio para cada um dos 78 poços das placas antes de remover o líquido das microesferas magnéticas como anteriormente.

Após adicionar cem microlitros de tampão de ensaio às esferas em cada uma das 78 poças nas placas, analise as placas no instrumento mag picks, consultando o manual do usuário para a operação adequada. Siga as instruções incluídas com o kit ELISA DUOset TNF Alfa T NF SF um humano dos sistemas r e d. Meça a resposta gerada pelo padrão fornecido com o kit r e d.

Repita o ensaio ELI a mais três vezes, substituindo os anticorpos de captura e detecção dos sistemas r e d pelos anticorpos dos outros fornecedores. Por simplicidade, associe os anticorpos por fornecedor e avalie cada par independentemente, conforme exigido pelo formato EISA, com cada um dos três padrões proteicos de TNF Alfa. Os ensaios Luminex Xap foram realizados em multiplex para avaliar os quatro anticorpos de captura como uma mistura, combinando quatro conjuntos de anticorpos anti-TNF alfa conjugados a microesferas Mag PLX; os anticorpos de captura foram avaliados com cada um dos quatro anticorpos de detecção biotinilados individualmente, de modo que a interação de um anticorpo de detecção com cada um dos quatro anticorpos de captura pudesse ser determinada simultaneamente.

Os resultados indicaram que o par de anticorpos do conjunto DUO dos sistemas r e d apresentou o melhor desempenho, com uma resposta resultante de 6.183 unidades de intensidade de fluorescência mediana ou MFI. Também foi observado que os anticorpos de detecção da Millipore e da ABAM proporcionaram uma resposta razoável no ensaio XAP quando combinados com o anticorpo de captura dos sistemas RD, enquanto os anticorpos de captura da Millipore, ACAM e Novus produziram uma resposta menos desejável no ensaio XAP. O protocolo do conjunto DUO dos sistemas r e d foi utilizado para comparar os quatro pares de anticorpos em formato EISA.

O protocolo dos sistemas r e d foi utilizado com todos os pares de anticorpos porque reflete os protocolos típicos de EIA amplamente usados atualmente e é análogo aos protocolos empregados com a tecnologia xap. Os testes de EISA mostraram que o par de anticorpos dos sistemas r e d novamente apresentou os melhores resultados. O par de anticorpos da Acam não produziu resposta, e os pares de anticorpos da Millipore e da Novas produziram respostas modestas, a fim de avaliar qualquer variação na reatividade dos anticorpos.

Com o padrão, todos os quatro pares de anticorpos foram testados com três diferentes proteínas padrão de TNF alfa recombinante de três fornecedores distintos. Os dados mostram que as proteínas padrão de TNF alfa recombinante dos três fornecedores apresentaram resultados equivalentes. A proteína de TNF alfa dos sistemas r e d foi utilizada para gerar curvas-padrão com os ensaios ELSA e XAP.

Embora o ensaio ELI A tenha sido realizado com o par de anticorpos do sistema r e d, os ensaios Xap utilizaram o anticorpo de captura do sistema r e d e, como anticorpo de detecção, o anticorpo do próprio sistema r e d ou o da Millipore. A proteína TNF alfa do sistema r e d foi diluída para produzir uma faixa de concentrações de 8.000 a quatro picogramas por mililitro apenas. O par de anticorpos do sistema r e d produziu o resultado esperado no ensaio Xap, com uma resposta superior a 20.000 MFI, conforme mostrado.

Quando o anticorpo de detecção da Millipore foi usado com o ensaio Xap no lugar do anticorpo de detecção dos sistemas r e d, a resposta foi cerca de 30% da resposta obtida com o anticorpo de detecção dos sistemas RD. A linha verde neste gráfico representa a curva padrão do ELA, que tinha uma faixa recomendada pelo fabricante de TNF alfa de 16 a 1000 picogramas por mililitro. Devido ao limite do espectrofotômetro, não foi possível aumentar a faixa do ensaio Eliza.

Além disso, a faixa dinâmica e a sensibilidade de ambos os métodos são melhor ilustradas quando representadas em escala logarítmica. Uma distinção clara entre a inclinação da resposta da EISA e as respostas dos ensaios xap pode ser observada, indicando ainda uma capacidade mais limitada de detecção do TNF alfa com a EL iza em concentrações tanto mais altas quanto mais baixas. Os limites de detecção, ou LOD, para os dois ensaios funcionais de TNF alfa xap foram aproximados identificando-se a menor concentração de TNF alfa com um nível de resposta observado superior ao fundo, acrescido de três vezes o desvio padrão (SD) obtido a partir de seis réplicas.

Aqui pode-se observar que, ao utilizar o par de sistemas r e d, a menor concentração de TNF alfa, de 3,91 picogramas por mililitro, produziu uma resposta de 66 MFI, superior à resposta do fundo mais três desvios padrão atendendo a este critério. Quando o anticorpo de detecção Millipore foi usado com o anticorpo de captura do sistema r e d, o limite de detecção foi inferior a 7,81 picogramas por mililitro.

Neste caso, a segunda menor concentração de TNF alfa produziu uma resposta aceitável de 17 MFI, superior à resposta da menor concentração de TNF alfa mais três vezes seu desvio padrão. Da mesma forma, estimou-se que o limite de detecção para o conjunto duplo de sistemas r e d da Eliza fosse entre 63 e 31 picogramas por mililitro. Após este procedimento, outras etapas, como testes, diferentes matrizes de amostras ou concentrações de anticorpo no sistema de detecção, podem ser realizadas para otimizar ainda mais o ensaio xap.