Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

O objetivo do seguinte procedimento é demonstrar como manter os lisossomos de dois tipos de amostras, embriões de camundongo e células-tronco diferenciadas, com corante lyo tracker para detectar padrões de morte celular. Para preparar as amostras de embrião, os embriões são primeiramente isolados cirurgicamente e colocados em uma placa para preparar as células diferenciadas. Células-tronco embrionárias são utilizadas para criar corpos embrionários.

Esses corpos embrionários são cultivados em suspensão e depois crescidos como uma monocamada sobre uma lâmina com câmara. A monocamada de embriões pode ser incubada em Ot Tracker Red e, em seguida, os espécimes são enxaguados e fixados, podendo então ser fotografados para examinar e quantificar os resultados da coloração, que mostram Liso Tracker. A coloração é um procedimento simples que pode ser utilizado para analisar a morte celular programada em embriões e células cultivadas.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a análise de tunel, é que, como o corante OT tracker é uma molécula pequena, tecidos espessos podem ser analisados rapidamente e com facilidade. Embora este método possa fornecer informações sobre os padrões de morte celular programada em embriões de camundongo e culturas diferenciadas, ele também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos, como embriões de galinha e células-tronco adultas em diferenciação. Acasale camundongas jovens com um macho reprodutor e, nas manhãs seguintes, verifique a presença de um tampão vaginal, o que indica que o acasalamento ocorreu.

O meio-dia do dia em que aparece o tampão vaginal corresponde efetivamente a 0,5 dia. Após a cópula, no dia embrionário de interesse, eutanizar a fêmea de acordo com os protocolos aprovados e remover o útero para uma placa de Petri de 10 centímetros com BSS de Hank, enxaguando todo o sangue. Separar os embriões e removê-los do útero.

Remova as membranas extraembrionárias e faça pelo menos uma lavagem com BSS de Hank para remover tecidos e sangue estranhos. Mantenha os embriões dissecados em gelo durante a limpeza. Os demais.

Prepare cinco mililitros da solução de coloração de embriões com Liso tracker. Este é um volume suficiente para uma ou duas coletas de embriões. Misture suavemente a solução para dispersar o corante, depois transfira os embriões para a solução e incube-os a 37 graus Celsius por 45 minutos.

Após a incubação, lave suavemente os embriões em BSS de Hank quatro vezes, com cinco minutos cada lavagem. É importante realizar as lavagens com cuidado para não danificar o tecido. Remova o líquido lentamente, prestando atenção constante à localização dos embriões delicados, e deixe sempre uma porção do líquido cobrindo-os.

Em seguida, fixe os embriões em paraformaldeído 4% durante a noite no dia seguinte. Lave os embriões uma vez em BSS de Hank por 10 minutos para remover o fixador. Agora, desidrate os tecidos por meio de uma série de metanol para eliminar a coloração de fundo.

Esta etapa melhora a relação sinal-ruído durante a imagem antes do armazenamento. Se necessário, colete uma amostra de tecido de cada embrião para análise genética. Posteriormente, reidrate a amostra de tecido antes da genotipagem.

Sequencie os embriões em tubos individuais com rótulos que correspondam à amostra de tecido. Agora é possível armazenar os embriões isolados indefinidamente em metanol a menos 20 graus Celsius. Protegidos da luz.

Inicie o preparo de corpos embrionários pelo método da gota suspensa. Com uma densidade inicial de 500 células por gota de 20 microlitros, após três dias transfira os corpos embrionários para culturas em suspensão em placas de Petri não aderentes de 10 centímetros. Incube por cinco dias, trocando o meio a cada dois dias após esses cinco dias.

Transfira os corpos embrionários para lâminas de oito câmaras gelatinizadas, colocando um ou dois corpos embrionários em cada câmara. Cultive os corpos embrionários por mais 10 dias. Após 10 dias, troque o meio a cada dois dias, aspire suavemente o meio existente e adicione 300 microlitros de solução de coloração de células Lyo tracker a cada câmara.

Tenha cuidado para pipetar manualmente o meio, colocando a ponteira da pipeta no canto da câmara. Dessa forma, você não removerá acidentalmente os corpos, que ainda estão se aderindo à superfície de vidro. Ao adicionar novamente o meio, coloque a ponteira da pipeta no canto da câmara e adicione o meio de volta muito lentamente.

Incube as câmaras a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, lave-as duas vezes com DPBS durante cinco minutos por lavagem. Agora, fixe as células em paraformaldeído 4% por 15 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, remova o fixador com DPBS em duas lavagens de cinco minutos cada. Para montar os embriões, coloque-os em uma lâmina de vidro com depressão profunda ou em uma placa de Petri pequena com escudo de infecção. Prepare as amostras celulares para microscopia aspirando o DPBS.

Remova a câmara da lâmina e deixe secar ao ar por cerca de cinco minutos. Cubra com papel alumínio para proteger o fluorocromo. Em seguida, adicione um meio de montagem aquoso, como o Vector Shield com DAPI, e coloque uma lamínula em cima.

Agora a lâmina foi montada e está pronta para a obtenção de imagens. Visualize as amostras com um microscópio estereoscópico ou composto equipado com filtro de bastão, domine ou Texas red. A coloração é tipicamente bastante intensa, portanto exposições longas geralmente não são necessárias no modo manual.

Tire fotos digitais de todas as amostras nas mesmas condições de exposição. Para quantificar as imagens, abra-as no Adobe Photoshop ou em um programa de processamento de imagens semelhante. Para determinar a quantidade de coloração com o marcador lyo, selecione o canal vermelho.

Observe a contagem de pixels para a imagem inteira conforme revelado pela função de histograma. Em seguida, aplique um limiar à imagem de modo que a coloração vermelha seja agora representada por pixels brancos. Isso converte a imagem em preto e branco.

Escolha um nível de limiar e utilize este nível para todas as imagens do conjunto. Selecione os pixels brancos utilizando a ferramenta de faixa de cores e use a função de histograma para obter a contagem total de pixels brancos. Utilize o canal azul para contar o número de núcleos no campo.

Pode ser útil manter um registro da contagem anotando a imagem, registrando os valores e utilizando-os para calcular o nível médio de coloração por célula. Repita esta análise com a mesma configuração de limiar para todas as imagens restantes. Para amostragem, o ly o tracker foi utilizado para corar embriões mutantes de sonic hedgehog.

Como o rastreador ly O é uma molécula pequena e altamente difusível, áreas profundas no interior da massa de um embrião inteiro foram coradas aos 10,5 dias pós-coito. A morte celular programada ou PCG estava grandemente aumentada em embriões mutantes nulos para sonic hedgehog, particularmente nas regiões dos membros e do tronco. Os botões dos membros foram analisados em preparações inteiras com maior aumento para avaliar o padrão geral. Porções dissecadas também foram seccionadas com um microtomo vibrante.

A seta aponta para uma coloração aumentada na ponta distal nula do hedgehog sônico em cortes obtidos com criostato. A coloração por túnel foi usada em conjunto com o OT Tracker nestes cortes, embora não haja uma correlação rigorosa um a um entre o marcador lyo e a coloração por túnel, as regiões gerais de morte celular programada apresentam considerável sobreposição sob maior aumento. É possível observar pontos que coraram positivo no ensaio TUNEL, mas não com o corante otra, pontos que coram apenas com o corante lyra e pontos que apresentam coloração sobreposta. Após 10 dias de cultura de embriões em blocos, as células se diferenciaram em uma variedade de tipos celulares, incluindo neurônios, células musculares e cardiomiócitos.

No cultivo normal de células ES diferenciadas, há algumas poucas células que sofreram PCD, conforme detectado pelos ensaios com lyo tracker e tunnel. Em seguida, as células foram tratadas com peróxido de hidrogênio para induzir morte celular por estresse oxidativo. Uma dose baixa de peróxido de hidrogênio aumentou tanto a marcação com lyo tracker quanto com tunnel, em comparação com a ausência de tratamento.

De forma semelhante aos resultados no embrião, ambas as colorações marcaram células comuns e únicas. Uma dose elevada de peróxido de hidrogênio resultou em retração celular e maior disseminação da positividade para OT tracker e TUNEL. Para comparação, a privação de soro foi utilizada para induzir autofagia após uma hora de privação de soro.

A marcação com OT tracker aumentou. No entanto, a positividade ao teste TUNEL permaneceu em níveis normais. Assim, embora o reer seja fácil e útil, é importante realizar ensaios adicionais para determinar se a marcação representa apoptose ou autofagia após a quantificação das amostras.

Utilizando o método simples do Photoshop demonstrado anteriormente, os resultados confirmaram que concentrações crescentes de peróxido de hidrogênio resultaram em um nível mais alto de marcação com Lys Tracker. Uma vez dominado, este procedimento de coloração pode ser realizado em menos de duas horas, se for executado corretamente seguindo este protocolo. Outros métodos, como a imunomarcação com NX-5 ou LC3, podem ser realizados para confirmar o tipo de morte celular. Não se esqueça de que atualmente o Trecker Green funciona apenas em células vivas, portanto o Reca Red é a melhor opção para amostras que exigem fixação.