Iterativo Otimização de Duplexos de DNA para Cristalização de SEQA-Complexos de DNA

Este experimento descreve como obter cristais de qualidade para difração de uma proteína ligada ao DNA contendo uma repetição em tandem de GATC metilado hemi. Repita para favorecer o empacotamento cristalino do complexo proteína-DNA. Comece com o planejamento racional do comprimento do DNA, do espaçamento entre os sítios GATC e das extremidades do DNA; prossiga com os oligonucleotídeos simples fita complementares para purificar o DNA e, em seguida, aqueça para formar o duplex de DNA hemimetilado; depois, misture com a proteína SeqA purificada para formar o complexo.

Em seguida, determine as condições ideais para cultivar cristais de qualidade para difração do complexo proteína-DNA por meio de ensaios de cristalização utilizando telas comerciais de matriz esparsa. Resultados demonstrados. Compartilhe o efeito da variação do comprimento do DNA, do espaçamento GATC e das extremidades sobre a qualidade de difração dos cristais de DNA CQ A.

O objetivo deste trabalho é obter cristais de qualidade para difração de CK ligada ao DNA, mas também pode ajudar a compreender as variáveis gerais que precisam ser consideradas ao projetar dupleixos de DNA para cristalização de outros complexos proteína-DNA. O procedimento demonstrado será utilizado em Chang, A, bolsista de doutorado do meu laboratório. Este estudo utiliza uma variante das proteínas reguladoras da replicação do DNA, Seek a, que forma dímeros estáveis e possui uma região de ligação encurtada entre seus domínios de oligomerização e de ligação ao DNA.

Esta variante restringe a ligação ao DNA a repetições tandem de GATC separadas exclusivamente por uma volta na primeira transformação de células BBL 20 1D com o plasmídeo que codifica DEMETRIC seq A sob o controle do promotor T sete. Plaque a reação de transformação em placas de ágar LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina e coloque no incubador bacteriano durante a noite. Escolha colônias mistas e inicie um cultivo noturno em pequena escala.

Na manhã seguinte, inocular uma cultura de um litro com 10 mililitros do inóculo preparado na noite anterior. Quando a cultura estiver na fase logarítmica, adicionar dois mililitros de IPTG 0,5 molar para induzir a produção da proteína. Continuar a incubação por três horas em um agitador orbital a 37 graus Celsius.

Em seguida, recolha as células por centrifugação a 3.300 ×g durante 10 minutos. Reese, suspenda o pellet celular em tampão de purificação, lise por sonicação e clarifique o lisado por centrifugação a 39.000 ×g durante 40 minutos. Agora, carregue o sobrenadante S em uma coluna de heparina equilibrada com tampão de purificação.

Para eluir a proteína CK, utilize um gradiente linear até um molar de cloreto de sódio; a proteína CK elui em torno de 0,7 molar de cloreto de sódio. Reúna as frações contendo CK e dilua para reduzir a força iônica da amostra.

Em seguida, carregue a amostra em uma coluna de cromatografia de troca catiônica E equilibrada com tampão de purificação. Aplique um gradiente linear de sal para eluir a proteína CK pura em torno de 0,4 molar de cloreto de sódio. Combine as frações contendo CK.

Concentre até três miligramas por mililitro e armazene em condições adequadas de armazenamento. Prepare um tampão com desenho complementar para oligonucleotídeos não metilados e metilados. Prepare amostras de um micromol de cada filamento simples de DNA liofilizado em 800 microlitros de água destilada e autoclavada, vortexie e deixe em repouso por 15 minutos agora e 800 microlitros.

Adicione previamente aquecido tampão de carga duas vezes a cada amostra; para oligonucleotídeos com comprimento de 20 a 30 nucleotídeos, prepare um grande gel desnaturante a 10%. Após a polimerização, remova o pente e enxágue bem os poços completamente. Monte o gel preenchendo os reservatórios superior e inferior com tampão de eletroforese TBE uma vez.

Pré-roteja o gel a 750 volts para aquecê-lo até 55 graus Celsius. Em seguida, interrompa a eletroforese e lave bem os poços com tampão em movimento. Agora aqueça os oligonucleotídeos a 90 graus Celsius por dois minutos.

Vortex e centrifugue. Os amostras seguem imediatamente para o carregamento do gel. Execute o gel a aproximadamente 700 volts até que o oligonucleotídeo tenha migrado.

No meio de um gel de poliacrilamida a 10%, o azul de fenol alfa co-migra com oligonucleotídeos com cerca de 20 bases de comprimento e o azul de xileno Syl FF com cerca de 60 bases de comprimento. Desmonte o gel do aparelho e remova os espaçadores sobre uma superfície plana. Remova uma placa de vidro e cubra o gel com filme plástico.

Em seguida, vire o gel, remova a outra placa de vidro e cubra o gel com filme plástico. Depois, marque as bandas utilizando luz UV e uma placa fluorescente atrás do gel. Para visualizar a sombra do DNA com uma lâmina de bisturi, recorte a banda e corte-a em pedaços pequenos.

Transfira cada amostra para um tubo estéril de 15 mililitros. Adicione nove mililitros de tampão eluente e dilua durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. Transfira cuidadosamente a solução para um tubo de centrífuga autoclavável usando uma ponteira de pipeta para carregamento de géis.

Para evitar a transferência de pedaços de acrilamida, adicione um mililitro de acetato de sódio três milli a pH sete mais 25 mililitros de etanol 100% gelado e incube a menos 20 graus Celsius por pelo menos três horas. Centrifugue o DNA precipitado. Em seguida, seque os pellets no speed vac com calor médio, reconstitua cada pellet em 400 microlitros de água autoclavada, duplamente destilada e transfira para um tubo novo.

Adicione 40 microlitros de acetato de sódio três molar com pH sete e um mililitro de etanol a 100%, vórtex e incube por 30 minutos a menos 20 graus Celsius após centrifugação por 15 minutos a 18.000 vezes. G, lave os pellets de DNA com 100 microlitros de etanol frio a 70% para remover qualquer sal residual, gire por seis minutos a 18.000 vezes. G, em seguida descarte o etanol e seque o pellet em um speed vac.

Agora, ressuspenda cada pellet em 100 microlitros de água destilada autoclavada. Determine a concentração dos oligonucleotídeos por espectrometria. Para preparar os duplex de DNA hemimetilados, primeiro misture concentrações molares iguais das fitas simples complementares.

Em seguida, aqueça as misturas a 95 graus Celsius em banho-maria por cinco minutos para desnaturar as fitas. Deixe as amostras esfriarem lentamente até a temperatura ambiente dentro do banho-maria. Combine volumes iguais de proteína CQ purificada a 81 micromolar e DNA hemimetilado a 81 micromolar.

Em seguida, incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Armazenar a quatro graus Celsius até o uso, realizando peneiramento para condições de cristalização utilizando telas comerciais de matriz esparsa. Uma vez identificadas as condições iniciais de cristalização, otimizar as mesmas para obter cristais de qualidade adequada para difração. Para crioproteger os cristais de DNA de CK resultantes.

Aumente a quantidade de PEG 400 presente na solução de cristalização até uma concentração final de 25% ou adicione 20% de glicerol à solução de cristalização. Retire os cristais individuais com um laço de náilon em flash. Congele as amostras em nitrogênio líquido.

Agora teste o limite de difração de cada cristal a 100 K. Para obter a estrutura cristalina da variante encurtada da CK ligada ao DNA hemimetilado, otimizamos consecutivamente três parâmetros no DNA: o espaçamento entre as sequências GATC hemimetiladas, o comprimento do duplex e a ausência ou presença de saliências 5'. Este estudo utiliza uma variante DME da seek a com uma mutação pontual no domínio terminal que impede a ligamentação adicional e um conector encurtado que restringe a ligação ao DNA em tandem.

Repetições de GATC separadas exclusivamente por uma volta nos ensaios de mobilidade eletroforética em DNA indicam que a proteína CK modificada se liga preferencialmente a repetições de GATC separadas por nove a 10 pares de bases. Portanto, as telas iniciais utilizam dímeros de 23 a 24 pares de bases de comprimento contendo duas metilações hemi. Repetições de GATC separadas por nove ou 10 pares de bases.

Três dímeros produziram cristais com boa forma. Embora nenhum dos cristais tenha difratado a alta resolução, os dados indicaram que a separação A-G-A-T-C de nove pares de bases era preferida para a cristalização, inesperadamente aumentando as interações entre a cadeia principal e o sulco; a inclusão de um dinucleotídeo CG entre os dois sítios GATC não alterou o limite de difração dos cristais.

Por outro lado, a otimização do comprimento dos overhangs alterou drasticamente os contatos moleculares e a morfologia do cristal. A estrutura cristalina dessa proteína CK ligada a um duplex de DNA hemimetilado confirmou que a face livre do duplex de DNA não participa de contatos cristalinos, apesar do tamanho relativo da proteína e do DNA; a maioria das interações entre moléculas simétricas é mediada por proteína, e por interações entre proteína e DNA. Curiosamente, neste caso específico, o efeito benéfico de um overhang de dinucleotídeo no extremo cinco primo não se deve à formação de um DNA pseudocontínuo.

Em vez disso, a extremidade cinco prima da fita metilada projeta-se para longe dos eixos do DNA e interage com a molécula de CK proximal do complexo, explicando por que dois nucleotídeos eram estritamente necessários para alterar o empacotamento cristalino. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar proteínas e projetar díades de DNA para a cristalização de complexos proteína-DNA. É importante lembrar que, embora este protocolo tenha sido desenvolvido para cristalizar o complexo CK-DNA, a otimização racional do comprimento, sequência e extremidades do DNA fornece uma estrutura geral para o projeto de díades de DNA destinadas à cristalização de outros complexos proteína-DNA.