Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é observar simbiontes bacterianos marcados com fluorescência dentro de seu hospedeiro nematoide. Isso é realizado primeiramente marcando as bactérias com uma proteína fluorescente por meio de conjugação. O segundo passo é isolar nematoides AIC coletando ovos.

Em seguida, os nematoides AIC são cultivados em combinação com seu simbionte bacteriano marcado com fluorescência para permitir a associação natural e, por fim, a localização do simbionte bacteriano dentro do hospedeiro nematoide. A frequência dessa associação dentro da população de nematoides pode ser determinada por microscopia de fluorescência. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de simbiose, como onde as bactérias se localizam dentro de seus hospedeiros e qual é a distribuição do transporte bacteriano ao longo de uma população de hospedeiros?

Após o crescimento noturno das cepas bacterianas, subcultive as cepas doadoras, receptoras e auxiliares em meio de crescimento rico em nutrientes, sem antibióticos, numa proporção de um para 100 de cultura para meio, e então cultive as culturas na temperatura apropriada para cada cepa até atingirem o estágio de crescimento logarítmico médio. Em seguida, combine as cepas em um único tubo de microcentrífuga e centrifugue as culturas mistas por dois minutos a 17.900 ×g, decante o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 30 microlitros de meio fresco. Depois, aplique a suspensão em uma placa de meio rico em nutrientes sem qualquer antibiótico e deixe a gota secar; quando a suspensão estiver seca,

Incube a placa invertida durante a noite em uma temperatura ideal para a bactéria receptora e permissível para o doador e o auxiliar, se aplicável. Em seguida, raspe o inóculo e faça o estriamento para colônias isoladas em uma placa com antibiótico seletivo para obter uma cultura pura de bactérias estriadas, uma única colônia para isolamento. Por fim, certifique-se de que as colônias resultantes sejam o simbionte receptor e não a linhagem doadora.

Ao realizar triagem para a presença de fenótipos específicos do receptor. Por exemplo, bactérias cino abdi podem ser diferenciadas de e coli mediante um teste de catalase, com triagem para a presença do plasmídeo por meio da confirmação da fluorescência sob o comprimento de onda correspondente à proteína fluorescente do plasmídeo. Após cultivar o simbionte bacteriano natural durante a noite, espalhe 600 microlitros da cultura bacteriana em oito a dez ágar-lipídio de 10 milímetros e, em seguida, incube as placas no escuro, sem umidade, a 25 graus Celsius.

Após dois dias, adicione 5.000 nematoides juvenis infectivos em 500 microlitros de meio às áreas bacterianas. Após incubação das placas a 25 graus Celsius por mais três dias, coloque 20 microlitros de água sobre uma lâmina de microscópio. Em seguida, use um palito estéril para raspar uma pequena quantidade de nematoides da área bacteriana.

Coloque o bastão na água para permitir que os nematóides nadem para fora. Observe este lâmina em baixa ampliação. Se ovos e fêmeas estiverem visíveis, continue quando as fêmeas contiverem ovos; coloque alguns mililitros de água sobre a superfície das placas, gire suavemente as placas e, em seguida, despeje a água em um tubo cônico de 50 mililitros.

Os nematoides devem sair das placas e não ser mais visíveis na superfície da placa. Deixe os nematoides sedimentarem no fundo do tubo, então aspire a água em excesso do topo do tubo e reencha o tubo com água limpa. Após deixar os nematoides adultos sedimentarem e remover a água em excesso com pipeta mais uma vez, preencha os tubos cônicos com a solução de ovos.

Em seguida, misture os tubos por inversão suave durante exatamente 10 minutos à temperatura ambiente. Após agitar, centrifugue imediatamente os tubos cónicos durante exatamente 10 minutos a 1.250 Gs e à temperatura ambiente, com o freio ligado. Em seguida, decante rapidamente o sobrenadante, ressuspenda o pellet com a solução de ovo por pipetagem e complete o tubo cónico com solução de ovo fresca.

Agite bem a suspensão de ovos invertendo o tubo de três a cinco vezes e, em seguida, centrifugue imediatamente os ovos e despreze o sobrenadante conforme mostrado anteriormente. Re-suspenda o pellet em caldo misogyno, caldo ou LB por pipetagem e, então, transfira a suspensão de ovos para um tubo cônico de 15 mililitros. Agora, complete o tubo de 15 mililitros com LB, lave os ovos três vezes no caldo utilizando a mesma técnica rápida demonstrada anteriormente e, em seguida, dilua os ovos de P. nematode a pelo menos 10 ovos por microlitro.

Transfira os ovos para uma placa de Petri de seis centímetros contendo cinco mililitros de LB e antibióticos contra bactérias colonizadoras. A placa pode ser armazenada envolta em perfil por até quatro dias após o crescimento noturno e seleção das bactérias fluorescentes. Use um bastão estéril para espalhar 600 microlitros da cultura bacteriana sobre aeróis lipídicos de 10 milímetros e incubar a cultura a 25 graus Celsius.

Após dois dias, distribua de 500 a 5.000 ovos de nematoides em cada placa de lipídio. Se a placa tiver sido armazenada, lave os ovos em 15 mililitros de LB, conforme acabou de ser demonstrado, pelo menos uma vez antes de inocular os ovos nas estrias bacterianas previamente preparadas. Em seguida, incube as culturas co-cultivadas de nematoides e bactérias no escuro e sem umidade a 25 graus Celsius até que as formas juvenis infectivas apareçam como um anel branco difuso na borda da placa.

Quando os juvenis infectantes forem observados, remova a tampa da placa de ágar lipídico e coloque o fundo da placa no interior do fundo de uma placa de Petri vazia de 100 milímetros por 20 milímetros. Em seguida, encha a placa de Petri com água suficiente para atingir cerca de metade da altura da placa menor e incube a armadilha de água até que os juvenis infectantes descendentes tenham emergido na água.

Após coletar os nematoides da água ou do estágio de vida desejado no gramado bacteriano apropriado, dissolva alguns grãos de ole em 30 microlitros de água e adicione um a dois microlitros deste agente paralisante para cada 50 microlitros da amostra de nematoide. Em seguida, transfira cerca de 20 a 30 microlitros da amostra de nematoide paralisado para uma lâmina de microscopia e coloque uma lamínula sobre a amostra. Observe os nematoides usando microscopia de luz para garantir que os nematoides estejam no campo de visão.

Para identificar a localização bacteriana. Fotografe os nematoides em microscopia fluorescente, além da configuração de microscopia de luz, e depois sobreponha as imagens. Pode ser necessário testar várias ampliações e vistas do nematoide para localizar as bactérias.

Uma população de nematoides provenientes de dois meios foi contada e avaliada quanto à colonização pelo simbionte bacteriano. Para obter estatísticas robustas, é recomendável contar pelo menos 100 nematoides por amostra, com pelo menos 30 em cada categoria, conforme mostrado na tabela. Esses nematoides apresentam níveis de colonização de aproximadamente 14,6% quando cultivados em ágar lipídico e de 68,6% quando cultivados em ágar fígado-rim.

Mostrou-se que outras espécies de nematoides e bactérias apresentam diferentes níveis de colonização. Este esquema ilustra a aparência geral de fêmeas de Steiner NEMA. O detalhe mostra a imagem de contraste de interferência diferencial de uma fêmea S fot gráfica com ampliação de 20 x.

A seta preta no detalhe indica a vulva, enquanto as setas brancas indicam ovos visíveis. Esta imagem mostra um ovo desenvolvido, mas não eclodido, de nematóide volt a 40 x de ampliação, e esses ovos isolados de nematóides s Volta foram visualizados com 10 x de ampliação. Aqui, imagens representativas de microscopia de nematóides Steiner Nima associados a bactérias Xeno aptus são mostradas nesta primeira imagem.

Os nematoides de Alvin estavam associados ao seu simbionte bacteriano expo que expressa GFP, criando esta imagem composta. Uma imagem de contraste de fase foi sobreposta a uma imagem fluorescente. A seta indica as bactérias presentes dentro do nematoide juvenil infectivo.

Esta imagem mostra um nematódeo juvenil de S carpa capsi com X nla expressando GFP. A imagem foi construída de maneira semelhante à imagem anterior e retrata o nematódeo juvenil com bactérias marcadas com proteína verde fluorescente visualizadas como bastonetes verdes localizados ao longo do lúmen intestinal do nematódeo. Além do procedimento descrito, outros métodos, como a manipulação genética do simbionte bacteriano antes da associação com o hospedeiro nematódeo, podem ser incorporados para responder perguntas adicionais, como quais são os mecanismos moleculares necessários para a associação entre o microrganismo e o hospedeiro.