Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

O objetivo geral do seguinte experimento é diferenciar células-tronco pluripotentes humanas ou H PSCs em neurônios utilizando um formato de placa de múltiplos poços. Isso é alcançado colhendo e semeando uma suspensão celular única de H PSCs em placas de fundo V de 96 poços para formar corpos embrioides ou EBS durante a noite.

Em seguida, os EBS são transferidos para placas ultra-baixas em formato de U contendo meio de diferenciação para induzir a formação do neuroectoderma. Posteriormente, os EBS são semeados em placas revestidas com matrigel para promover a proliferação de neurônios. Os resultados podem ser obtidos por imunofluorescência, mostrando a presença de marcadores neurais típicos por volta do oitavo dia.

Protocolos de coloração para diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em neurônios são frequentemente complicados e tediosos. De forma algo acidental, descobrimos um procedimento muito simples para produzir neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas.

Do ponto de vista técnico, a principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que ela é fácil de realizar, rápida e economicamente eficiente. Ao mesmo tempo, o procedimento será apresentado pela Dra. MI Z do laboratório. Prepare o meio de formação de corpos embrioides e o meio de diferenciação conforme descrito no protocolo escrito.

Cultive hPSCs em condições livres de camada de sustentação, como meio condicionado por metilo em placas revestidas com Matrigel, ou utilizando sistemas de cultura quimicamente definidos, sob condições de crescimento ativo e subconfluentes. Com um microscópio estereoscópico e uma ponteira de pipeta de plástico estéril, remova mecanicamente as colônias diferenciadas espontaneamente. Lave as colônias indiferenciadas remanescentes com PBS e utilize Accutase contendo um x inibidor de ROCK para digestão em células isoladas.

Pelote as células individuais por centrifugação a 200 G durante dois minutos e ressuspenda em um pequeno volume de meio de formação de EB. Utilize um hemocitômetro para determinar a titulação celular. Adicione células adicionais ao meio de formação de EB restante para obter uma titulação entre 40.000 e 80.000 células por mililitro.

Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microlitros por poço para uma placa de fundo V de 96 poços, resultando em 4.000 a 8.000 células por poço. Centrifugue a placa em uma centrífuga com rotor pendular a 400 ×g por um minuto para recolher todas as células no fundo dos poços. Transfira as células para um incubador e permita a formação de EBS durante a noite, observando no dia seguinte ao microscópio estereoscópico.

Colete EBS e transfira em um pequeno volume para uma placa bacteriana de 3,5 centímetros contendo dois mililitros de meio de diferenciação. Lave as células girando suavemente a placa. Adicione 100 microlitros de meio de diferenciação a cada poço de uma placa com aderência ultrabaixa.

Placa de fundo de 96 poços sob um microscópio estereoscópico. Transfira EBS em pequenos volumes do recipiente de lavagem para os poços U de 96. Incube os EBS por quatro dias para permitir a formação de neuroectoderma no quarto dia.

Lave as células com meio de diferenciação e semeie-as individualmente nos poços de uma placa multiwell revestida com matrigel, como uma placa de 12 poços. As células devem ser distribuídas uniformemente nos poços para permitir o crescimento indisturbado de neurônios. Deixe os EBS aderirem fracamente ao matrigel por aproximadamente 10 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, transfira cuidadosamente a placa para a estufa. Os neurônios crescerão a partir dos EBS plaqueados de maneira radial ao longo dos próximos quatro dias. Anteriormente, demonstramos que, em consonância com muitos outros estudos, EBS a partir de H PSCs podem ser gerados simplesmente por replaqueamento de agregados durante a divisão rotineira de H HPCs em placas de baixa adesão.

Isso geralmente resulta em uma ampla distribuição de tamanhos celulares. Outro problema é que EBS mantidos em suspensão tendem a se agregar uns aos outros, levando a uma heterogeneidade de tamanho ainda maior. Para contornar isso, H PSCs individuais foram semeados em poços de baixa adesão, o que resultou na ausência de formação de EBs e morte celular. No entanto, a combinação da molécula de sobrevivência celular, Y 2 7 6 3 2, com álcool polivinílico, que tem demonstrado melhorar a formação de EBs a partir de HSCs, permitiu a formação de EBS a partir de suspensões de HESCs individuais durante a noite.

Convenientemente, os tamanhos dos EBs nesse formato de placa de múltiplas diluições puderam ser rigorosamente controlados ajustando-se diferentes números de células por poço. Em contraste com o uso de técnicas convencionais, após a transferência dos EBs para placas 96 U com aderência ultrabaixa, a formação de neuroectoderma foi induzida usando um coquetel de moléculas pequenas composto pelos inibidores F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA dois e BP SMA um, o que permitiu então que as células fossem semeadas sobre matrigel para gerar neurônios. A indução da formação de EBs a partir de cerca de 8.000 células proporcionou a melhor capacidade de diferenciação neuronal, caracterizada por projeções neurais acentuadas provenientes dos EBs semeados.

Centros necróticos reduzidos em corpos embrioides após o plaqueamento e alta expressão de marcadores sensoriais e pan-neuronais, como B rrn três A e beta três tubulina. As eficiências gerais de diferenciação neuronal parecem ser comparáveis ao procedimento original, que até o momento é aplicável tanto a HSCs quanto a HI PSCs. Três linhagens independentes de HPSCs, incluindo células HES e HIPS, foram testadas com sucesso no procedimento em multi-bem, embora a variabilidade dependente da linhagem celular e as eficiências de diferenciação geralmente não possam ser descartadas.

Esta figura mostra células neuroectodérmicas dissociadas do quarto dia, semeadas como células individuais e diferenciadas com sucesso com eficiência aproximada de 60%. Manipular EBS na plataforma multipoço requer um pouco de treinamento no início, mas após algum tempo, você verá que é bastante fácil.