Estudo quantitativo de locomoção livremente Natação Micro-organismos Usando Difração Laser

O objetivo geral deste procedimento é medir as frequências de movimento oscilatório de organismos microscópicos nadando livremente. Isso é realizado primeiramente preparando uma amostra de vermes microscópicos. Em seguida, o arranjo óptico é preparado.

Então, o padrão de difração introduzido pelos organismos vivos é registrado. Por fim, os dados registrados são analisados para determinar as frequências de natação. Em última instância, a análise de difração é utilizada para mostrar alterações nos padrões de locomoção de vermes sem restrições.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia tradicional, é que os padrões de natação podem ser observados enquanto a espécie se move livremente em um espaço tridimensional. Embora este método possa fornecer informações sobre a natação livre de C. elegans, ele também pode ser aplicado a outros organismos transparentes, pequenos e microscópicos expostos a condições variadas. Para preparar C. elegans para análise de vídeo, comece usando uma alça de fio de platina achatada para transferir de 10 a 20 nematoides adultos GR para um meio NGM fresco.

Placas de Petri com ágar contendo pequenas manchas circulares de e coli. Deixe os nematoides depositarem ovos por três a cinco horas e, em seguida, remova os adultos. Assim, estabelece-se uma pequena cultura com desenvolvimento sincronizado de 50 a 150 nematoides; para cultivar os nematoides até a fase inicial da idade adulta, incube as placas de Petri a 20 graus Celsius por quatro a cinco dias.

No dia da análise em vídeo, use um mililitro de água destilada desionizada para lavar uma placa de nematoides jovens adultos, coletando assim 50 a 150 vermes da cultura sincronizada. Use uma microcentrífuga para sedimentar os vermes no fundo do tubo ou deixe-os sedimentar por gravidade por cerca de 15 minutos. Remova a maior parte da água do tubo e substitua por um mililitro de água destilada desionizada para remover eventuais bactérias aderidas aos nematoides.

Usando uma micropipeta, transfira de cinco a dez nematoides em água para um vete de quartzo. Monte a configuração óptica conforme mostrado aqui, utilizando um laser de hélio-neônio de 543 nanômetros para superamostragem, dois espelhos de superfície frontal de alumínio usados para direcionar o feixe do laser através do vete, um suporte para vete, uma tela de projeção e uma câmera de alta velocidade capaz de filmar a aproximadamente 240 quadros por segundo. Em seguida, use um pedaço de paraforma para cobrir a parte superior do vete e inverta-o para misturar os nematoides na coluna de água.

Coloque o tubo em um suporte para tubo de modo que os vermes fiquem inicialmente próximos ao topo do tubo. Usando os espelhos, direcione o feixe do laser através do centro do tubo. Como os nematoides são mais densos que a água, eles cairão lentamente para o fundo do tubo enquanto nadam na coluna de água; na tela de projeção, pinte de preto a região correspondente ao feixe de laser transmitido para reduzir a dispersão quando o feixe transmitido atingir a tela de projeção.

Eliminar ou reduzir o espalhamento do feixe transmitido manterá a matriz CCD da câmera sem saturação devido ao feixe transmitido. Para capturar uma medida do tamanho do padrão de difração, trace uma linha de cerca de cinco centímetros na tela de projeção ao lado do ponto do feixe de laser transmitido, sem interferir na imagem da luz difratada. Desligue a luz do ambiente e registre as imagens de difração na tela enquanto os vermes passam pelo feixe de laser.

Para preparar os dados do vídeo, instale o seguinte programa de análise de vídeo e importe o vídeo para o programa. Defina a origem para coincidir com o ponto do laser transmitido usando o software. Acompanhe o deslocamento angular da imagem de difração formada por cada nematódeo.

Copie e cole os dados em uma planilha e adicione 180 graus ou PI para todos os ângulos negativos, a fim de produzir um gráfico contínuo. Usando a configuração de análise de vídeo, posicione um fotodiodo com uma pequena área descentralizada no padrão de difração diretamente em frente à tela de projeção por meio de uma porta USB.

Conecte o fotodiodo ao osciloscópio digital que está conectado ao computador. Observe os padrões de movimento na tela do computador. Salve os conjuntos de dados em formato ASCI ou texto para analisar os dados.

Use o vídeo ou a foto para importar os dados para um programa de análise de dados capaz de ajustar formas de onda. Utilizando o método de minimização qui-quadrado, ajuste uma curva senoidal para determinar a frequência de contorção. Calcule a média das frequências de natação de várias amostras e determine a variância.

Para este estudo, os dados foram analisados estatisticamente utilizando um fator único Inova, seguido pelo Bon Ferran. O teste de comparações múltiplas considerou um valor de P inferior a 0,05 como estatisticamente significativo para modelar padrões de difração. Comece usando um microscópio para capturar imagens a fim de dimensionar uma imagem.

Arraste-o para o Mathematica. Use o comando binary eyes para convertê-lo em preto e branco. Alternativamente, use o comando edge detect para criar uma imagem em preto e branco, em que os dois números finais controlam a grossura das bordas resultantes.

Em seguida, utilizando o comando de dados da imagem, converta a imagem em uma matriz de zeros e uns. Use o comando forer para transformar a matriz, eleve ao quadrado o valor absoluto da matriz e visualize a imagem resultante, que é o padrão de difração correspondente à imagem original. Além disso, utilize a função logarítmica para ajustar o contraste da imagem.

Por fim, compare os padrões de difração do modelo com os padrões de difração obtidos de vermes nadando livremente. Neste exemplo, foram estudados exemplares de sea elegance em uma cubeta de quartzo Q, com um centímetro de largura, cinco milímetros de espessura e quatro centímetros de altura. Análise de vídeo para amostrar um único verme.

A frequência média de natação obtida a partir da análise de vídeo em um meio com espessura de cinco milímetros foi de aproximadamente 2,5 hertz. De forma semelhante, a amostragem de um único verme utilizando o método de aquisição de dados em tempo real e um osciloscópio digital resultou em uma frequência de natação de cerca de 2,7 hertz. Este procedimento pode ser repetido para muitos vermes.

Um estudo detalhado de vermes nadando livremente revelou uma frequência média de natação de 2,37 hertz em um vete de cinco milímetros. Como esperado, a frequência de natação é maior do que aquela de um verme rastejando. Utilizando este método de difração, descobriu-se que as frequências médias de natação de uma *elegância marinha*, confinada a uma lâmina de microscópio, correspondem ao valor previamente publicado de dois hertz.

Após o vídeo. A preparação de dados e a modelagem de padrões de difração demonstradas neste vídeo permitem a modelagem de padrões de difração de natação. Com a ajuda de imagens de vermes obtidas com um microscópio convencional, os padrões de difração modelados são utilizados para simular um ciclo de nado do sea elegance.

Um modelo bem-sucedido consiste em padrões de natação fisicamente viáveis, compatíveis com as frequências de natação. O verme deve apresentar a mesma forma ao final do ciclo de natação que tinha no início do ciclo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de um minuto para cada verme, utilizando a dieta fotográfica rápida enquanto se observam os ciclos de natação na tela do computador.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar nematoides nadando livremente.