Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise

O objetivo geral deste procedimento é obter cortes coronais hipofisários adequados com arquiteturas de tecido bem preservadas de camundongos em desenvolvimento. Este procedimento pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento hipofisário, como histologia hipofisária, diferenciação celular, proliferação e apoptose. A principal vantagem dessa técnica é que as hipófises murinas em desenvolvimento podem ser dissecadas sem danos visíveis e devidamente orientadas para a obtenção de cortes coronais.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando descobrimos que, para o desenvolvimento de hipófise murina, era tecnicamente difícil obter cortes coronais adequados. Depois de anestesiar e fixar os ratos de acordo com o protocolo de texto, use uma tesoura para cortar o osso do crânio. Em seguida, com uma pinça, levante suavemente o rombencéfalo da base do crânio.

Então, ao primeiro sinal da sela túrcica, pare de levantar, mas segure o rombencéfalo e use uma tesoura fina para cortar o pedúnculo da hipófise e as fibras nervosas conectadas à base do cérebro. Continue a levantar e remover todo o cérebro para expor totalmente a glândula pituitária. A glândula pituitária repousa sobre a superfície dorsal do osso esfenoidal e é circundada lateralmente pelos nervos trigêmeos.

Em seguida, use uma tesoura para cortar toda a região selar, incluindo a glândula pituitária, os nervos trigêmeos laterais e abaixo do osso esfenóide. Coloque o tecido em uma placa de 35 mm contendo 4% de PFA e incube-o a 4 graus Celsius por 40 minutos a 3 horas, dependendo da idade. Em seguida, use 10 mL de PBS para lavar o tecido fixo por cinco trocas em 15 minutos cada.

Transfira o tecido fixo para uma placa de 35 mm contendo 1 mL de PBS e, sob um microscópio estéreo, dissocie as glândulas pituitárias. Para as hipófises P5 a P14, com pinças finas e tesouras, remova as membranas conjuntivas entre os nervos e o osso e isole cuidadosamente a glândula pituitária junto com os nervos trigêmeos laterais como um todo, mas deixando a sela túrcica. Para P21 e hipófise adulta, remova os nervos e as membranas conjuntivas ao redor da hipófise e liberte a glândula dos tecidos circundantes.

Após a desidratação, limpeza de xileno e infiltração de cera realizada de acordo com o protocolo de texto, em um sistema de console de incorporação de tecido, remova a amostra do e coloque-a em um molde de base preenchido até a metade com cera de parafina derretida. Para glândulas pituitárias P21 e adultas, use pinças finas aquecidas para posicionar a glândula pituitária com seu eixo curto perpendicular à superfície inferior de um molde de base. Para hipófises P0 a P4, oriente as amostras com seus ossos esfenóides perpendiculares à superfície inferior de um molde de base.

Para glândulas pituitárias P5 a P14, oriente as amostras com seus nervos trigêmeos perpendiculares à superfície inferior de um molde de base. Depois de posicionar a glândula, use uma pinça fina aquecida para manter suavemente o tecido na posição desejada até que a cera se torne semi-sólida em uma placa de resfriamento. Complete o molde com cera de parafina derretida.

Deixe o bloco de parafina esfriar até que a cera esteja totalmente solidificada. Resfrie o bloco de parafina a menos 20 graus Celsius por 10 a 20 minutos e, em seguida, use um micrótomo para cortá-lo em fatias finas, ajustando a posição do bloco de parafina durante o corte. Realizar a imunomarcação de acordo com o protocolo de texto.

Como mostrado aqui, para dissecar a glândula pituitária do camundongo neonatal, toda a região selar contendo a glândula pituitária, os nervos trigêmeos e o osso esfenóide abaixo foram dissecados da base do crânio. A minúscula e delicada glândula pituitária permaneceu intacta durante o processo. Para camundongos com mais de cinco dias, as glândulas pituitárias ligadas aos nervos laterais do trigêmeo foram isoladas.

A estrutura de crescimento da glândula pituitária isolada do camundongo P7 foi bem preservada. Aqui, a glândula pituitária do camundongo P21 foi isolada com sucesso sem danos visíveis durante a remoção do tecido circundante. Nesta figura, a coloração H & E de cortes coronais adequadamente orientados demonstra morfologia bem preservada da adeno-hipófise e da neuro-hipófise nas glândulas pituitárias P0, P7 e P21.

Por fim, as lâminas processadas também foram compatíveis com a marcação por imunofluorescência. Como exemplo, a adeno-hipófise e a neuro-hipófise apresentaram imunomarcação específica de GH e GFAP, respectivamente. Uma vez dominado, o processo de dissecção à incorporação pode ser feito em 7,5 horas em camundongos adultos e ainda menos em camundongos mais jovens, se for realizado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de dissecar toda a região selar para evitar tocar a glândula pituitária com quaisquer ferramentas cirúrgicas. Seguindo este procedimento, a hipófise que não foi prefixada também pode ser isolada. Nesse caso, deve-se ter mais cuidado para evitar danos indesejados.

A glândula também deve ser dissecada o mais rápido possível. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar as glândulas pituitárias de camundongos e preparar seções coronais hipofisárias em diferentes estágios de desenvolvimento.