Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

O objetivo geral deste procedimento é preparar sinaptossomos com atividade translacional a partir do córtex cerebral de camundongo, utilizando um gradiente de densidade de sacarose percal descontínuo. Isso é realizado primeiramente coletando e homogenizando os córtices de camundongo, e então centrifugando o homogenato. Após isso, aplique o homogenato centrifugado, ou sobrenadante, aos gradientes pré-formados de sacarose percal.

O passo final é centrifugar e coletar a fração de sinaptossomos. Em última análise, análises por western blot e experimentos de incorporação de metionina S 35 mostram que a fração de sinaptossomos é enriquecida sinapticamente e ativa do ponto de vista traducional. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como centrifugação e filtração, são: primeiro, os danos mecânicos são evitados mediante o uso de gradientes de densidade, e segundo, a toxicidade por célula é baixa em relação aos constituintes celulares.

De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades com este protocolo porque o tempo desempenha um papel fundamental. Uma vez que os córtices tenham sido coletados, o procedimento deve ser rapidamente concluído. Para iniciar o procedimento, prepare as camadas de gradiente de 3, 10, 15 e 23% adicionando as quantidades respectivas de SIP, conforme descrito no manuscrito suplementar, ao tampão GM e misture bem.

Despeje as camadas em gradiente pipetando dois mililitros de cada uma das 23 soluções isotônicas de Percoll a 15, 10 e 3% em tubos de centrífuga Beckman com tampas. Utilizando uma pipeta P1000, a interface entre as camadas deve ser claramente distinguível, sem mistura entre elas. Armazene os gradientes a quatro graus Celsius por pelo menos 20 minutos antes do uso.

Antes de iniciar este procedimento, prepare as demais soluções necessárias conforme descrito no manuscrito suplementar. Eutanase o camundongo na idade de P13 a P21 e prepare-o para a dissecação borrifando o pescoço e a cabeça com etanol 70%. Em seguida, use uma tesoura afiada para cortar a medula espinhal na base do crânio.

Em seguida, remova a pele do topo do crânio. Corte o crânio lateralmente entre o osso parietal e o osso interparietal, ou entre as regiões do cérebro e da córtex. Depois disso, corte o crânio desde a base até o nariz ao longo da sutura sagital.

Neste passo, remova cuidadosamente o osso parietal mole puxando cada hemisfério para o lado. Em seguida, insira a espátula no cérebro acima do cerebelo para retirar o córtex. Coloque-o em tampão GM gelado e repita os procedimentos novamente para coletar mais córtices.

Agora lave os córtices em tampão GM frio. Em seguida, transfira dois córtices para um homogeneizador de vidro contendo cinco mililitros de tampão GM frio. Homogeneíze suavemente os córtices com cinco a dez movimentos do pistilo A, o pistilo solto, seguidos por cinco a dez movimentos do pistilo B, o pistilo ajustado.

O número de golpes varia conforme o homogeneizador individual. Transfira o homogenato para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue a 1000 vezes.

Centrifugar por 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga Allegra six KR para obter o pellet de detritos celulares e núcleos. Sobrepor dois mililitros do sobrenadante por gradiente de sacarose, utilizando um gradiente para cada córtex completo, e tampar os tubos. Em seguida, centrifugar em rotor de ângulo fixo a 32.500 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga Beckman J 2 21.

Usando adaptadores apropriados ao finalizar, o gradiente deve apresentar uma faixa SN forte; pipete e descarte a solução acima da faixa SN. Usando uma pipeta de vidro, pipete a faixa SN na interface de 15 a 23%; um gradiente geralmente fornece cerca de 0,9 a 1,1 mililitros de sns. Em seguida, transfira para um tubo cônico e mantenha em gelo.

Em seguida, ajuste a concentração de sal do SNS adicionando um décimo do volume de tampão de estimulação 10 vezes concentrado. Opcionalmente, adicione cloreto de cálcio 1000 vezes concentrado para obter uma concentração final de 12 amolar. A seguir, adicione o estoque de TTX de um milimolar para obter uma concentração final de um micromolar, a fim de suprimir a excitação não específica.

O próximo passo é utilizar o SNS na aplicação a jusante apropriada, como estudos de tradução proteica. Para outras aplicações, o lisado de SN pode ser purificado ou concentrado usando o kit de preparação de amostras Pierce SDS page. A concentração proteica do SNS pode ser determinada utilizando o kit de ensaio proteico micro BCA.

Aqui está um exemplo de seis bandas ou frações. Quando o córtex de camundongo foi homogeneizado e separado em gradientes descontínuos de sacarose Percoll, as SNS enriquecidas foram contidas na banda cinco, na interface de 23 a 15%; essa banda foi removida e examinada por microscopia eletrônica. Um exemplo de vesículas sinápticas intactas e da preservação dos elementos pré-sinápticos e pós-sinápticos é mostrado aqui no western blot.

Um aumento nos marcadores sinápticos e uma diminuição nas impurezas na banda de SN a partir de um gradiente descontínuo de sacarose demonstram que o aumento da incorporação de metionina S 35 após a adição de glutamato é devido à síntese de novo de proteínas. Foi adicionado 40 micromolar de anesa micina, um inibidor da síntese proteica. Esta figura mostra a acentuada redução na incorporação de metionina S 35 na presença de anso micina, com ou sem glutamato, quando comparado aos níveis basais.

Assim, os gradientes descontínuos de sacarose peral produzem rapidamente SNS altamente ativos e relativamente puros, que podem ser utilizados para estudar a tradução proteica. Esta figura mostra que a banda cinco do gradiente descontínuo de sacarose per core contém os níveis mais altos de síntese proteica *de novo*. Os SNS preparados fazendo o homogenato do córtex passar por uma série de filtros com tamanho de poro decrescente e, em seguida, centrifugando sobre um gradiente descontínuo de sacarose per core para comparação, contêm mais membranas rompidas e menos SNS inteiros do que os SNS preparados pelo método do gradiente descontínuo de sacarose perol. Os SNS preparados utilizando o método do gradiente descontínuo de sacarose peral demonstraram conter maior atividade de síntese proteica *de novo* do que os SNS preparados utilizando o método de filtração.

Mostra-se que SNS preparados de camundongos mais jovens possuem maior atividade translacional do que de camundongos mais velhos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como isolar zonas neurosinápticas com atividade translacional ativa, homogeneizando córtices de camundongos, centrifugando o homogeneizado em um rotor de braço oscilante, centrifugando o sobrenadante sobre um gradiente de sacarose Percoll em um rotor de ângulo fixo e, em seguida, coletando a faixa de zona neurosináptica resultante.