O Lambda selecione cII sistema de deteção de mutação
26 de abril de 2018
Descreveremos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII Lambda selecione em culturas de células de roedores transgênicos ou correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos.
O objetivo geral deste protocolo é visualizar procedimentos passo a passo envolvidos no ensaio de mutação Lambda Select cII em células cultivadas de roedores transgênicos ou nos animais correspondentes tratados com agentes químicos e físicos de interesse. Este método de teste pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa de mutação, como: um composto de teste é mutagênico? E se sim, quão potente é um mutagênico?
Induz mutações específicas de sequência? A principal vantagem dessa técnica é que ela é mínima para praticamente qualquer composto de teste. O método pode ser utilizado para testes de mutagenicidade em células de mamíferos utilizando um gene repórter cromossomicamente integrado.
Para constituir uma única reação de empacotamento, adicione cinco microgramas de DNA genômico em um tubo de microcentrífuga contendo a primeira mistura de reação. Em seguida, incube o tubo a 30 graus Celsius por 90 minutos. Após a incubação, adicione 12 microlitros da segunda mistura de reação ao tubo e deixe por mais 90 minutos a 30 graus Celsius.
Após 90 minutos, adicione 1,1 mililitros de tampão SM ao tubo. Em seguida, agite vigorosamente o tubo com o DNA embalado em temperatura ambiente por cerca de 10 segundos. Dê rapidamente um giro de pulso na microcentrífuga.
Em seguida, deixe o tubo no gelo até o uso. Em seguida, adicione 50 microlitros de clorofórmio para cada mililitro de DNA empacotado. Se a amostra não for processada no mesmo dia, faça um vórtice suave da amostra e armazene-a a quatro graus Celsius por até duas semanas.
Prepare 16 tubos de fundo redondo estéreis e 16 placas de ágar TB1 para uma única amostra de DNA embalada. Use dez tubos para triagem e seis para titulação. Em seguida, alíquota de 300 microlitros de cultura de revestimento G1250 em cada tubo inferior redondo.
Em seguida, para titular, adicione 10 microlitros de DNA empacotado a 990 microlitros de tampão SM e diluição 1:100. Em seguida, vórtice a amostra. Adicione 20 ou 100 microlitros da solução de DNA 1:100 a cada um dos três tubos de título 20 ou 100, respectivamente.
Para fins de triagem, adicione 100 microlitros da amostra de DNA embalada não diluída a cada um dos 10 tubos de triagem. Processe todos os 16 tubos de titulação e peneiramento. Vortex os tubos por 10 segundos para misturar os componentes.
Em seguida, incube os tubos em temperatura ambiente por 30 minutos para que a E.coli hospedeira absorva os fagos. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de ágar TB1 fundido. Mantenha esses 55 graus Celsius para os tubos de titulação e triagem apropriados.
Após a adição, bata imediatamente os tubos suavemente. Agora, despeje o ágar TB1 no título apropriado ou na placa de ágar TB1 de peneiramento. Deixe as placas repousarem por 15 a 30 minutos em temperatura ambiente.
Assim que o ágar solidificar, inverter e deixar todas as 10 placas de peneiramento na incubadora estacionária a 24 graus Celsius por 46 a 48 horas. Deixe as seis placas de titulação restantes em uma incubadora estacionária a 37 graus Celsius durante a noite ou um dia. Após a incubação a 37 graus Celsius, conte o número de placas formadas em todas as 3 placas de titulação 20 e titulação de 100
.Após a incubação a 24 graus Celsius, conte o número de placas formadas nas 10 placas de triagem. Para verificar as placas mutantes putitivas, retire o núcleo da placa com uma ponta de pipeta estéril de diâmetro largo. Em seguida, transfira a placa para um tubo de microcentrífuga estéril cheio de 500 microlitros de tampão SM estéril.
Em seguida, incubar o tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente durante pelo menos duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, misture um microlitro da solução de fago tubular com 200 microlitros da cultura de plaqueamento G1250 em um tubo inferior redondo estéril. Em seguida, incube a mistura em temperatura ambiente por 30 minutos.
Após 30 minutos, coloque a solução de fago tubular em 2,5 mililitros de ágar TB1 fundido e incube a 24 graus Celsius por 46 a 48 horas. Quando as placas secundárias estiverem visíveis, use uma ponta de pipeta para pegar uma única placa mutante Lambda cII bem isolada. Transfira a placa para um tubo de microcentrífuga cheio de 25 microlitros de água bidestilada em pipeta várias vezes.
Deixe o tubo em água fervente por cinco minutos. Em seguida, centrifugue o tubo a 18.000 vezes G por três minutos à temperatura ambiente. Imediatamente após a centrifugação, transferir 10 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga contendo 40 microlitros da mistura principal de PCR.
Após a amplificação por PCR, purificar o produto para-amplificado de base 432 com o gene cII e suas regiões flanqueadoras incorporadas usando o kit de purificação por PCR. Em seguida, sequencie o transgene cII usando um analisador de DNA para detectar as mutações. As placas obtidas nas placas do título 20 e do título 100 são claramente visíveis segurando-as ao lado de uma caixa de luz branca e contra um fundo escuro.
Aqui, o gráfico de barras descreve a potência mutagênica de vários produtos químicos nos compostos físicos testados. Isso é feito analisando a extensão do aumento na frequência relativa do mutante cII isolado dos blastos de fibras embrionárias de camundongos. O gráfico de barras mostra todos esses reagentes de teste mostrando um aumento estatisticamente significativo na frequência do mutante cII.
Em seguida, são demonstrados os espectros de mutação do transgene cII nos blastos de fibras embrionárias de camundongos irradiados com UVB. O gráfico de pizza mostra um aumento significativo na frequência relativa da transição de citidina para timidina única ou em tandem nos dinucleotídeos de pirimidina quando comparado ao controle. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em oito a dez horas se for executada corretamente, excluindo os tempos de preparação para placa de estrias bacterianas em cultura.
No sequenciamento de DNA, após a pontuação dos mutantes cII. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise de mutação de um composto de teste em um sistema modelo in vitro.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o ensaio de mutação cII do Lambda Select, que é utilizado para avaliar a mutagenicidade em células cultivadas de roedores ou animais transgênicos expostos a diversos agentes. Este método é essencial para compreender o potencial mutagênico de compostos em teste.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa de mutação
- Testes de genotoxicidade
- Avaliação de carcinógenos
Contexto
- O ensaio de mutação cII do Lambda Select é um método amplamente reconhecido.
- Ele avalia os efeitos mutagênicos de agentes químicos e físicos.
- Este ensaio utiliza um gene repórter integrado ao cromossomo.
- Ele fornece informações sobre a potência e especificidade de mutagênicos.
Objetivo do Estudo
- Visualizar os procedimentos passo a passo do ensaio de mutação cII do Lambda Select.
- Determinar se um composto em teste é mutagênico e sua potência.
- Investigar a indução de mutações específicas de sequência.
Métodos Utilizados
- Utilização de células cultivadas de roedores transgênicos.
- Exposição a agentes químicos e físicos de interesse.
- Avaliação da mutagenicidade por meio de um gene repórter.
- Visualização passo a passo dos procedimentos do ensaio.
Resultados Principais
- O ensaio identifica efetivamente compostos mutagênicos.
- Ele demonstra a potência de diversos agentes em teste.
- Mutações específicas de sequência podem ser analisadas.
- O método é adaptável a uma ampla variedade de compostos em teste.
Conclusões
- O ensaio de mutação cII do Lambda Select é uma ferramenta valiosa na pesquisa de mutações.
- Ele fornece dados essenciais sobre a mutagenicidade de compostos.
- Este protocolo aprimora a compreensão dos mecanismos mutagênicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O sistema de detecção de mutação cII Lambda Select permite a avaliação quantitativa do potencial mutagênico em células de mamíferos, apoiando a triagem precoce de genotoxicidade no descobrimento de fármacos. Ao medir a frequência e o espectro de mutantes, fornece insights mecanicistas que ajudam a reduzir riscos de compostos líder antes de investimentos significativos. Este ensaio sustenta decisões orientadas por dados de avançar/não avançar no desenvolvimento pré-clínico, identificando agentes reativos ao DNA com confiança estatística.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos mecanismos de dano ao DNA e a validação funcional do risco genotóxico em candidatos principais.
- Valor Operacional: Fornece um sistema repórter integrado ao cromossomo para detecção de mutações consistente e reprodutível entre diferentes tipos celulares.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de frequência de mutantes para classificar a potência mutagênica de compostos em teste.
- Valor Operacional: Fornece leituras padronizadas baseadas em placas, compatíveis com formatos de triagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Caracteriza espectros de mutação (por exemplo, transições C→T induzidas por UVB) para vincular o mecanismo a alertas estruturais.
- Valor Operacional: Apoia a extrapolação entre espécies a partir de modelos de roedores transgênicos para a relevância humana.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se na cascata de testes de genotoxicidade, auxiliando a descoberta inicial até a otimização do composto líder ao fornecer dados quantitativos de mutagenicidade antes de ensaios tradicionais, como o de Ames ou o de micronúcleo.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre vias de reparo do DNA e elucidação de mecanismos mutagênicos.
- Triagem: Permite pontuação reprodutível e quantitativa de placas mutantes para priorização de compostos.
- Análises: Fornece dados de frequência e espectro de mutantes para modelagem de relações estrutura-atividade.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro à mutagenicidade in vivo por meio de modelos de roedores transgênicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para perfis de mutagenicidade em diversas áreas terapêuticas e modalidades.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na avaliação de risco genotóxico por meio da análise do espectro de mutações.
- Valor Operacional: Garante a reprodutibilidade do ensaio por meio de protocolos padronizados de resgate de fagos e plaqueamento.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao filtrar compostos mutagênicos promissores no início da descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em limiares quantitativos de mutagenicidade.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em biologia molecular, técnicas com fagos e análise de sequência de DNA.
- Depende de sistemas de empacotamento de fago lambda, cepas bacterianas hospedeiras e meios de cultura seletivos em ágar.
- Necessita padronização entre equipes dos grupos de toxicologia de descoberta e genômica analítica.
- As considerações de adaptação incluem eficiências variáveis de transfeção em linhagens celulares primárias e imortalizadas.
- As limitações práticas incluem a duração do fluxo de trabalho, que leva vários dias, e a sensibilidade à qualidade e pureza do DNA genômico.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:52
In Vitro Packaging Reaction
1:51
Plating the Packaged DNA Samples
3:36
Examination of the Titer and the Screening Plates to Determine the Putative cll Mutants, Verification of Mutant Plaques, PCR Amplification, and DNA Sequencing
5:31
Results: Use of λ Select cll Assay to Detect Mutations in the cll Transgenes from the Genomic DNA
6:31
Conclusion
