Combinando Microscopia de Limpeza e Fluorescência para Visualização de Mudanças na Expressão Gênica e Respostas Fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Plasmodiophora brassicae é o patógeno biotrófico obrigatório transmitido pelo solo que ataca plantas da família Brassicaceae. Após a infecção, o patógeno desencadeia o desenvolvimento de galhas nas partes subterrâneas da planta, daí o nome da raiz do clube da doença. O desenvolvimento de galhas é acompanhado por uma reprogramação muito complexa.

Portanto, a possibilidade de rastrear mudanças internas durante a doença é crucial para a compreensão dessa interação planta-patógeno. Nosso protocolo melhora a imagem de complexos, espessos e galhas. Facilita a visualização de mudanças na expressão gênica, respostas fisiológicas, equilíbrio fitohormonal, progressão da doença, distribuição de esporos e lignificação local.

O protocolo preserva proteínas fluorescentes dentro das amostras, permitindo o armazenamento e processamento de objetos por um longo tempo. Também permite o rastreamento de mudanças bioquímicas e estruturais que acompanham a progressão da doença. Demonstrando o procedimento estarão Sara Blicharz, pesquisadora de pós-doutorado em nosso grupo, Deeksha Singh, estudante de doutorado de nosso laboratório, e Kornel Michalak, estudante de doutorado do grupo Professor Agnieszka Bagniewska-Zadworna da Universidade Adam Mickiewicz.

Comece preparando o tecido vegetal. Remova cuidadosamente o solo dos sistemas radiculares de plantas infectadas e não infectadas por raiz de clube. Limpe bem com água e colete hipocótilos e galhas em tubos de microcentrífuga.

Fixar as amostras em 200 a 500 microlitros de fixador de paraformaldeído durante uma hora à temperatura ambiente, aplicando um vácuo constante de 700 milibares utilizando uma bomba de vácuo. Certifique-se de que o objeto está completamente imerso na solução de paraformaldeído. Use 4%agarose para incorporar hipocótilos não infectados e galhas infectadas.

Ferva a solução para dissolver a agarose e despeje-a quando esfriar enquanto ainda estiver viscosa. Seque o objeto ligeiramente em um tecido por alguns segundos para remover o excesso de paraformaldeído. Use palitos de dente ou pinça para incorporar e orientar o objeto da planta em agarose com cuidado.

Para evitar seções oblíquas, certifique-se de que o objeto esteja orientado e moldado corretamente para que seu eixo seja perpendicular ao plano da lâmina do vibratome. Para acelerar a solidificação da agarose, coloque uma placa de Petri ou multicultura a quatro graus Celsius por 10 minutos. Usando uma lâmina, corte e molde cuidadosamente o objeto dentro de um bloco de agarose, observando a orientação preferida para o seccionamento.

Cole o bloco de agarose ou a fel grande para montá-lo corretamente no suporte do espécime usando cianoacrilato ou cola instantânea e fita adesiva. Ajuste a espessura para seções, velocidade e amplitude de vibração de acordo com a espessura e o tamanho da galha. Adicione água destilada ao banho-maria e comece com a secção.

Colete cuidadosamente as seções usando pinça ou escova e transfira-as para um tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de buffer PBS 1X. Remova 1X PBS do tubo de microcentrífuga e adicione 200 a 500 microlitros de solução de limpeza. Substitua a solução de limpeza pela nova se a sua cor mudar após algum tempo durante o processamento da amostra.

Realizar a coloração calcofluor-branco para as paredes celulares das células vegetais de saída, preparando 5% da coloração branco-calcofluor na solução de limpeza. Em seguida, manche as células no escuro por pelo menos cinco minutos. Coloração lipídica com vermelho do Nilo e ligninas com coloração básica de lignina Fuchsin, conforme descrito no manuscrito do texto, e monte as seções limpas na lâmina de microscopia.

Em seguida, observe as células sob uma epifluorescência ou um microscópio confocal. Use vários modos de aquisição para obter imagens de mais de um espectro de fluorescência simultaneamente. A dinâmica da doença e o acúmulo de patógenos foram rastreados em galhas colonizadas por Plasmodiophora brassicae, e grandes células com esporos de repouso de P.brassicae foram observadas após a coloração vermelha do Nilo.

As alterações na diferenciação do xilema após a infecção por P.brassicae foram visualizadas usando a coloração Basic Fuchsin. As plantas de Arabidopsis que abrigam o construto pHCA2:erRFP foram utilizadas para visualizar a expressão gênica de HCA2 no tecido floema dentro de galhas de raiz de clube. HCA2 co-localizado com o floema nos estágios finais do desenvolvimento da galha impulsionado por P.brassicae, e a atividade gênica refletiu o mecanismo pelo qual P.brassicae aumenta a complexidade do floema.

Aos 16 dias após a inoculação, as respostas diferenciais de citocinina entre plantas infectadas e não infectadas foram avaliadas verificando-se a expressão do marcador TCS:GFP em galhas em desenvolvimento. As respostas de citocinina parecem estar significativamente diminuídas em galhas infectadas, enquanto permaneceram fortes, especialmente no pool de floemas, em plantas não infectadas. As etapas mais críticas são a fixação no PFA, a incorporação e o seccionamento.

Para o corte do vibratome, é preciso otimizar e ajustar cuidadosamente os parâmetros de velocidade, amplitude e espessura para obter seções de boa qualidade. As técnicas de seccionamento de vibratomos e limpeza de tecidos abriram o caminho para melhorar a análise microscópica das respostas fisiológicas durante as interações planta-micróbio e os tecidos que exibem crescimento secundário com anatomia celular complexa.