Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

Olá, sou Kevin Won. Sou aluno de mestrado em engenharia no Laboratório de Biofluidos da Universidade Cornell. E hoje vou falar sobre o uso de um dispositivo microfluídico baseado em agarose para estudar o efeito do fator de crescimento epidérmico (EGF) em células-tronco neurais murinas.

O dispositivo consiste basicamente em três canais microfluídicos, cada um com 150 mícrons de largura. O FGE é bombeado para um dos canais laterais e o tampão é bombeado para o outro canal lateral. Isso basicamente estabelece um gradiente químico linear estático ao longo do canal central.

Como o EGF difunde facilmente através do gel de agarose, as células-tronco neuronais são semeadas no canal central e o progresso de sua migração é monitorado por meio de um microscópio. Assim, os dispositivos são basicamente compostos por uma camada superior de plexiglass que possui todas as entradas e saídas para conexão com os tubos. E abaixo dessa camada há uma membrana de gel de agarose, que contém quatro dispositivos padronizados.

Isso é cercado por um espaçador de PDMS, o que garante espessura constante em todo o dispositivo. O PDMS e o gel são montados sobre uma lâmina de vidro, revestida com ect. Isso ajuda as células a aderirem à lâmina de vidro.

Além disso, a placa de aço inoxidável é usada para montar todo o dispositivo, e nós montamos o dispositivo em sanduíche com parafusos. A linhagem celular selvagem foi transfectada com um vetor de retrovírus para superexpressar o receptor EGF selvagem, e a linhagem celular delta foi transfectada com uma versão mutada do receptor EGF que permite que ele seja constitutivamente ativo sem o ligante EGF. Ok, então vou começar explicando o processo de montagem do nosso dispositivo microfluídico.

Então, primeiramente coloquei o espaçador de PDMS ao redor das características em relevo dos microcanais de silício em nossos moldes. Agora vou pesar 0,3 gramas de agros. Em seguida, vou adicionar 10 mililitros de meio independente de CO2 e misturá-los aos agros.

E vou pipetar para cima e para baixo para misturar o pó de agros com o meio independente de CO2. Agora estamos prontos para o micro-ondas. Como você pode ver agora, o agros está liquefeito, mas ainda restam alguns grânulos.

Vou tentar movimentar suavemente para dissolver o grânulo e eliminar as bolhas de ar. Estou despejando o ágar fundido sobre as características em relevo do molde de silício e agora pegarei uma lâmina de vidro estéril e a colocarei sobre o espaçador de PDMS. E a coloco em um ângulo para tentar expulsar a maioria das bolhas de ar presentes no gel de ágar.

E apliquei pressão e continuarei aplicando pressão até que a casca de agros se solidifique. Após um a dois minutos, ela estará solidificada. Agora vou remover o excesso de agros da lâmina.

O próximo passo é deslizar suavemente a lâmina de vidro, que pode então ser descartada. Agora vou tentar transferir cuidadosamente o padrão de agros para uma lâmina de vidro que previamente recobri com fibronectina. Basicamente, uso esta folha estéril de plástico para me ajudar a levantar o padrão de agros com o espaçador de PDMM MS, e vou transferir o padrão de agros com os canais voltados para baixo em direção à lâmina.

Agora que isso está firmemente fixado na lâmina de vidro, farei furos nos reservatórios individuais para que o coletor de plástico tenha acesso aos canais. Farei isso usando um furador metálico pequeno. Agora concluímos a perfuração dos furos no dispositivo.

Vou adicionar 500 microlitros de meio independente de CO₂ para evitar a dessecação dos microcanais e agora vou deixar repousar por um a dois minutos. Ok, após um a dois minutos, tentarei drenar o meio em excesso e agora alinharei os orifícios perfurados no padrão de agros com os orifícios de entrada e saída do manifold de plexiglass. E uma vez que os orifícios estejam alinhados, pressiono firmemente para formar um bom selamento.

Agora coloco a placa de plexiglás sobre os suportes de aço inoxidável e, em seguida, vou montar cuidadosamente o dispositivo usando parafusos. Tenho muito cuidado para não apertar em excesso os parafusos, pois isso comprimiria os canais, e insiro os parafusos em sentido horário para evitar que o gel Agros interno se desloque. Vou aspirar um mililitro de meio e usarei esta seringa para testar o dispositivo.

E como você pode ver, estou injetando fluido em cada microcanal e verificando a saída do fluido em cada descarga. No momento, coloquei o dispositivo montado na câmara ambiental do microscópio. Esta é mantida a 37 graus Celsius, o que aquecerá o dispositivo e o preparará para o momento em que precisarmos semear as células.

E como você pode ver, já passei os dois tubos da bomba parasol através da montagem. E agora estou lavando os tubos com PBS em preparação para nossos experimentos. Então, agora vamos montar os tubos.

Vou passar a tubulação da bomba do parasol através das tampas com furos já perfurados. Cada tubulação tem um número específico de entalhes para que eu possa identificar tanto a entrada quanto a saída da tubulação. Assim, a tubulação com quatro entalhes receberá 10 nanogramas por mililitro.

A solução de EGF agora será conectada ao dispositivo por meio do tubo. Então, vou conectá-la a cada dispositivo de acordo com o número de entalhes que ele possui, de modo que corresponda à solução que está sendo aspirada.

E agora conecto a tubulação de saída. Usamos uma tubulação de tigon transparente para garantir que o meio esteja realmente fluindo pela tubulação de saída e que não haja obstruções no canal. E agora iniciarei as bombas parasol.

Agora iniciarei o procedimento para semear as células no canal central. Começarei removendo o meio em excesso do canal do sensor. Agora verei as células.

As células já estão em suspensão em meio independente de CO2. E eu as semeei, coloquei 60 na entrada do canal central e adicionei 20 microlitros na saída. E espera-se que as células se depositem por meio de fluxo impulsionado pela gravidade.

E repetirei este procedimento para os outros dois canais sensíveis e agora observaremos isso ao microscópio para verificar se a adesão celular foi bem-sucedida. Agora as células aderiram à lâmina de vidro e, em alguns minutos, começarão a se espalhar e adquirir sua morfologia característica. Hoje abordamos a montagem do dispositivo propriamente dito, a preparação dos reagentes e as técnicas de microscopia que utilizo para obter imagens da migração celular dentro do dispositivo.

Em conclusão, esperamos que este dispositivo tenha uma aplicação muito mais ampla, especificamente no ambiente clínico. Assim, observe a figura um na horizontal. Ela mostra as trajetórias das células C17.2 e as concentrações crescentes de EGF na vertical.

Mostra as trajetórias das várias linhagens das células C17.2 que utilizamos em nossos experimentos com a mesma concentração de EGF. Os dados das células parentais mostram um pico na motilidade na gradiente de concentração de 10 nanogramas por mililitro de EGF, indicando que os receptores ficaram saturados com ligante em uma concentração mais alta de EGF. E os dados do tipo selvagem mostram um aumento na motilidade na concentração de cem nanogramas por mililitro de EGF.

Isso indica que os receptores não ficam saturados em concentrações mais altas de EGF. Isso faz sentido, já que eles foram projetados para superexpressar o receptor de EGF. Por fim, os dados da linhagem celular delta indicam que a motilidade das células é aproximadamente independente da concentração de EGF.

Isso também era esperado, já que os receptores de EGF mutados foram projetados para serem ativados independentemente da presença de EGF.