Очистка и визуализация гриппа Вирусный комплексы рибонуклеопротеидных

Данная процедура начинается с удаления любых примесей из раствора вируса гриппа путем центрифугирования. Затем вирусная мембрана разрушается с помощью детергента, и высвобождаемые VR nps разделяются на глицериновом градиенте.

Фракции центрифугирования из градиента собирают и анализируют аликвоту каждой фракции. На SDS-PAGE гели окрашивают кумасси синим для определения пиковых фракций, содержащих V NPS; затем эти фракции концентрируют путем центрифугирования, и очищенные VRP наносят на медную сетку для ТЭМ, которую затем подвергают негативному окрашиванию для визуализации VRP с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Здравствуйте, я Уинко Ву из лаборатории доктора Нелли Пейн на кафедре зоологии Университета Британской Колумбии.

Меня зовут Линдси Уивер, я ранее работала в лаборатории Пейна. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру очистки вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов вируса гриппа. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения ядерного импорта вируса гриппа A в клетках культуральных тканей.

Итак, приступим. Для начала эксперимента добавьте 750 µL буфера MNT в одну поликарбонатную центрифужную пробирку Beckman размером 11 мм на 34 мм. Затем добавьте в пробирку 500 µL раствора вируса гриппа A с концентрацией 2 mg/mL, после чего несколько раз пропипетируйте содержимое вверх-вниз для перемешивания вируса с буфером MNT.

После перемешивания поместите пробирку в ротор TLA one 20.2 и центрифугируйте в центрифуге Beckman Optima max E в течение 10 минут при 109,000 ×g и температуре 4 °C. По окончании центрифугирования удалите супернатант, затем ресуспендируйте осадок в 500 µL буфера для дезинтеграции. Интенсивно перемешайте ресуспендированный осадок на вортексе, а затем инкубируйте при 31 °C в течение 20 минут в термомиксе Eppendorf.

После завершения встряхивания приступайте к центрифугированию в градиенте глицерина для определения скорости седиментации. Для подготовки градиента глицерина поместите в центрифужную пробирку Beckman UltraClear размером 13 мм на 51 мм следующие объемы глицерина: 1 мл 70% (об. %) GLYCEROL, 0,75 мл 50% глицерина, 0,375 мл 40% глицерина и 1,8 мл 33% глицерина. Данные растворы глицерина готовят путем смешивания чистого глицерина с буфером NM.

Также подготовьте балансную пробирку, содержащую глицерин и буфер. Затем снова перемешайте образец разрушенного вируса на вортексе и нанесите его на глицериновый градиент. Поместите пробирку в ротор с качающимися стаканами Beckman MLS 50 и центрифугируйте градиент в течение 3 часов 45 минут при 217 000 ×g и температуре 4 °C.

После завершения центрифугирования вручную соберите аликвоты градиента по 250 µL, начиная с верхней части пробирки. Храните фракции на льду или при температуре 4 °C. После сбора фракций можно приступить к их анализу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с SDS.

Для начала анализа методом SDS-PAGE перенесите по 20 µL из каждой фракции в отдельные пробирки. Затем добавьте 5 µL 5-кратного буфера для образцов SDS-PAGE и нагрейте образцы при 95 °C в течение пяти минут. После нагревания кратко центрифугируйте образцы и нанесите их на 10% полиакриламидный гель, поместив маркеры молекулярной массы в одну из лунок. Затем проведите электрофорез образцов в геле до тех пор, пока краситель бромфеноловый синий не достигнет нижней части геля.

Извлеките гель из аппарата для SDS-ПААГ и окрасьте его кумасси синим. На основании результатов окрашивания определите фракции, содержащие преимущественно нуклеопротеин вируса гриппа.

Белок NP вируса гриппа A имеет молекулярную массу примерно 56 килодальтон и является основным белком в составе вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов. Таким образом, полоса NP, как правило, является наиболее интенсивной в фракциях, содержащих vRNP. В следующей части мы сконцентрируем эти фракции vRNP.

Объедините глицериновые фракции, содержащие преимущественно NP, и распределите их по двум поликарбонатным центрифужным пробиркам Beckman размером 11 мм на 34 мм; заполните каждую пробирку ультрачистой водой, обработанной этилпирокарбонатом или DEPC. Затем несколько раз пропипетируйте содержимое для перемешивания. Поместите пробирки в ротор Beckman TLA 120.2 и центрифугируйте в течение четырех с половиной часов при 157 000 ×g и температуре 4 °C.

По завершении центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок. Очищенные V NPS распределите по аликвотам в 50 µL воды, обработанной DEPC; одну аликвоту отберите для использования, а остальные храните при -80 °C. Теперь можно приступать к негативному окрашиванию VRPs.

Разведите 1 µL очищенного VRNP в 9 µL свежеприготовленного и дважды фильтрованного ПСБ-буфера; подвергните медную сетку для ПЭМ свечения в тлеющем разряде в течение 30 секунд. Эта сетка была предварительно покрыта Parlow Dion и углеродной пленкой. Удерживая только что обработанную сетку пинцетом, нанесите на нее каплю разведенного VRNP объемом 5 µL.

В течение восьми минут ожидания дайте капле впитаться в сетку. Поместите небольшую полоску парафильма в лоток, затем нанесите на парафильм две капли PBS-буфера по 10 µL каждая, а также каплю свежеприготовленного окрашивающего раствора объемом 80 µL, состоящего из 1% мелидата аммония. Теперь промойте сетку с образцом, осторожно погрузив ее в две капли PBS на общее время одну минуту.

Затем с помощью кусочка фильтровальной бумаги удалите часть раствора образца с сетки с объектом, не допуская ее высыхания. Сразу после удаления последней капли буфера с сетки полностью погрузите ее в каплю красителя. Подождите одну минуту.

Спустя одну минуту с помощью нового кусочка фильтровальной бумаги полностью удалите раствор красителя с сеточки с образцом. Дайте сеточке с образцом высохнуть на воздухе в течение нескольких минут перед наблюдением. Ниже представлены репрезентативные изображения негативно контрастированных V nps, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа.

Как видно здесь, V NPS представляют собой стержневидные частицы переменной длины, составляющей приблизительно от 30 nanometers до 120 nanometers. Олигомерная NP организована в виде цепи молекул NP, которая далее сворачивается в структуру с двойным спиральным повтором. Поэтому на обоих концах этих стержневидных частиц иногда можно наблюдать петли.

Мы только что продемонстрировали вам способ очистки и визуализации вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов гриппа. При выполнении данной процедуры важно не использовать PBS для разведения VRNPs, если вы применяете урацилацетат для негативного контрастирования.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.