Жидкая фаза Affinity Capture методом с использованием магнитных шариков по изучению белок-белковые взаимодействия: Полиовирус-нанотела Пример

В данном протоколе используется взаимодействие между полиовирусом и распознающими нанотелами к полиовирусу для демонстрации простого количественного анализа аффинного захвата в жидкой фазе. В основе метода лежит использование магнитных частиц с кобальтовым покрытием для осаждения меченых белков, а также любых взаимодействующих с ними радиоактивно меченых белков. Сначала смешайте меченые и tagged-белки и инкубируйте их при комнатной температуре.

Затем добавьте магнитные бусины, распознающие метку, и с помощью магнитов отделите связанную фракцию меченого белка от несвязанной. После этого измерьте сигнал меченого белка, обнаруженного в несвязанной фракции, и определите его количество в этой фракции. Результаты этого анализа аффинности в жидкой фазе крайне полезны при исследовании белков, чувствительных к конформационному переходу.

Данный анализ аффинного захвата в жидкой фазе позволяет изучить взаимодействие между нанотелами, распознающими полиовирус, и различными антигенами полиовируса. Этот метод также может быть применен для изучения других белок-белковых взаимодействий при условии, что один белок может быть мечен, а другой — детектирован. Мы впервые разработали этот метод, когда возникла необходимость исследовать взаимодействие между нанотелами, распознающими полиовирус, и различными антигенами полиовируса.

Поскольку полиовирус чувствителен к конформационным изменениям при прикреплении к твердой поверхности, использование e LSA ограничено. Таким образом, предпочтение следует отдавать системе на основе жидкой фазы. Примером такой системы на основе жидкой фазы, часто используемой в исследованиях полиовируса, является микробелковый анализ.

Метод иммунопреципитации. Несмотря на доказанную эффективность данного теста, он требует наличия кристаллической структуры обычного антитела, которой нет у нанотел. Эти нанотела, представляющие собой стабильные однодоменные антитела, могут быть легко модифицированы с помощью различных последовательностей.

Широко используемый His-тег обладает сродством к бивалентным ионам, таким как никель и кобальт, которые, в свою очередь, могут быть легко нанесены на магнитные бусины. В связи с этим мы разработали простой количественный анализ аффинного захвата на основе магнитных бусин с покрытием из кобальта.

Перемешайте запас магнитных бусин с помощью вортекса и перенесите по 10 µL для каждого образца в пробирку, затем осадите бусины с помощью магнита. Удалите прозрачный супернатант, чтобы промыть бусины. Добавьте 150 µL связывающего буфера.

Соберите гранулы с помощью магнита и слейте супернатант после второго промывания. Перевзвесьте гранулы в 40 µL связывающего буфера для каждого образца и контроля. Для определения фона в первом образце подготовьте лунку без радиоактивно меченого вируса, но с равным объемом связывающего буфера для контроля.

Возьмите образец со 100% радиоактивностью. Добавьте в лунку все компоненты, заменив нанотело буфером для связывания. Затем добавьте во все образцы полиовирус штамма 7 типа 1, меченный S 35, с активностью 2000 имп/мин, до общего объема 80 µL буфера для связывания.

Примите контрольный образец. Образец один. Добавьте по 10 µL разведения нанотела в каждый образец.

Тщательно перемешайте в течение 10 секунд на шейкере и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Затем добавьте 40 µL промытой суспензии магнитных частиц и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре при непрерывном перемешивании, осадите частицы с помощью магнита и перенесите очищенный супернатант в пробирку для измерения радиоактивности каждого образца, перенеся 50 µL супернатанта в счетную колбу. Добавьте три миллилитра смеси сцинтилляционной жидкости и проведите измерение на сцинтилляционном счетчике.

Промойте использованные магнитные бусины в пробирке с помощью воды и центрифугируйте при 500 ×g в течение двух минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте бусины в 6 мл 0,5 М гидроксида натрия. Затем разлейте суспензию по нескольким пробиркам и инкубируйте в ультразвуковой бане в течение пяти минут.

После осаждения бусин с помощью магнита и удаления супернатанта добавьте в каждую пробирку один миллилитр 2% раствора SDS, затем перемешайте с помощью вортекса и фольги в течение пяти минут. Теперь соберите бусины. Добавьте в каждую пробирку один миллилитр 0,2 молярного EDTA с pH семь и инкубируйте пробирки в ультразвуковой бане в течение пяти минут.

Затем соберите гранулы, трижды промойте их одним миллилитром воды, а затем одним миллилитром 10 миллимолярного раствора хлорида кобальта. Поместите пробирки на шейкер на 10 минут. Затем соберите гранулы с помощью магнита и ресуспендируйте их в одном миллилитре буфера для связывания.

Промойте дважды в одном миллилитре 20% Ethanol, затем повторно суспендируйте гранулы в их исходном объеме 20% ethanol, чтобы получить регенерированные гранулы в концентрации 40 мг/мл. Скорректируйте фоновую радиоактивность, установив контрольный образец один как значение 0% радиоактивности, а контрольный образец два — как значение 100% радиоактивности.

Теперь для каждого образца рассчитайте процент радиоактивности в супернатанте как показатель общего осаждения радиоактивно меченого вируса с помощью нанотела. В данном эксперименте оценивается аффинность PVSS 38 C и антитела, специфичного к полиовирусу, с использованием трех различных антигенов полиовируса: нативного антигена, нагретого антигена и 14 s субъединиц. Примечательно, что радиоактивность в супернатанте образцов, содержащих радиоактивно меченые 14 s субъединицы, снижается при увеличении концентрации нанотела PVSS 38 C. Это указывает на увеличение количества 14 s субъединиц полиовируса, связавшихся с нанотелом PVSS 38 C и, опосредованно, с магнитными бусинами.

Поскольку сродство pvs S 38 C к N-антигенной и H-антигенной формам полиовируса не наблюдается, нанотело, по-видимому, специфично для 14 s субъединицы полиовируса. Сродство нанотела к своим антигенам, измеренное этим методом, специфично, в отличие от несвязанного нанотела. NB one не проявляет реактивности по отношению к трем антигенным формам полиовируса.

Данная система обеспечивает высокую воспроизводимость, что подтверждается этой кривой зависимости «доза-эффект», построенной разными исследователями в разные дни. После освоения метода этот надежный анализ захвата на основе аффинного связывания в жидкой фазе может быть полностью выполнен в течение двух часов, включая регенерацию бусин. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать данный анализ захвата на основе аффинного связывания в жидкой фазе с применением магнитных бусин при изучении взаимодействия между различными белками, особенно в тех случаях, когда невозможно использовать системы на твердой фазе.