Обработка Лоблолли Пайн PtGen2 кДНК Microarray
20 марта 2009 г.
КДНК микрочипов PtGen2 был разработан для изучения экспрессии генов в ладанной сосна, П. taeda, И других хвойных пород. Здесь мы покажем, пре-и пост-гибридизация обработки и мытья методов, которые могут быть использованы с этого массива для получения лучшей консистенции, снижение артефактов, и нижний фон.
Данное видео было подготовлено исследователями из Школы лесного хозяйства и природных ресурсов имени Уорнелла при Университете Джорджии. Цель данного обучающего видео — подробно описать процесс обработки нашего микрочипа на основе кДНК второго поколения для LOB lolly pine pt, уделяя особое внимание промывке и обращению с чипом как до, так и после гибридизации. В целом наши протоколы соответствуют методикам, разработанным в Институте геномных исследований (TIGR) и Центре общих ресурсов микрочипов Университета Вандербильта (VMSR), где осуществляется печать наших чипов.
Мы обнаружили, что для обеспечения максимальной согласованности в отношении равномерности качества сигнала и низкого уровня фона требуется более строгая обработка PT Gen two. Первым этапом является предварительная промывка. Это необходимо, поскольку наш буфер для нанесения пятен содержит очень высокую концентрацию солей, и предварительная промывка требуется для их удаления.
Предметные стекла помещают в кассету для микроскопических стекол и интенсивно погружают 15–20 раз в 0,2% раствор SDS, предварительно нагретый до 43 °C. После промывки в растворе SDS стекла осторожно переносят пинцетом в банку Копленда с буфером для прегибридизации. Этот буфер содержит 5X SSC, 0,1% SDS и 1% BSA и также нагревается до 43 °C.
Стеклянный сосуд Копленда накрывают парафильмом и помещают в инкубатор при температуре 43 °C на один час. После прегибридизации предметные стекла переносят в кассету для предметных стекол и последовательно промывают в пяти сменах деионизированной воды, погружая стекла по 15–20 раз в каждую смену. В завершение стекла помещают в изопропанол, окунают пять или шесть раз, после чего центрифугируют до полного высыхания в центрифуге Chip-M-Mate.
После центрифугирования предметные стекла обдувают сжатым воздухом, прошедшим через фильтр с порами 0,2 мкм. Затем на предметные стекла накладывают покровные стекла, которые также были очищены сжатым воздухом; с помощью кончика небольшой пипетки покровное стекло устанавливают в правильное положение на предметном стекле.
После размещения подъемных полосок, но перед добавлением гибридизационного буфера, мы добавляем 20 µL 100 мМ дигидрокси-триаттола в увлажняющие лунки, расположенные по краям камеры. Теперь мы готовы добавить целевые кДНК, которые были ресуспендированы в гибридизационном буфере. Кончик пипетки помещают на край подъемной полоски и предметного стекла, после чего медленно вносят раствор.
Мы обнаружили, что использование капиллярного эффекта для заполнения массивов обеспечивает наибольшую стабильность и значительно снижает вероятность попадания нежелательных пузырьков воздуха. После добавления целевого материала в массив собирают гибридизационную камеру и накрывают ее алюминиевой фольгой. Затем гибридизационную камеру помещают в шейкер-термостат с водяной баней для инкубации в течение ночи, обычно от 14 до 16 часов.
Водяную баню устанавливают на 48 °C, а шейкер — на 50 rpm. Также важно отметить, что с момента добавления раствора для гибридизации и на протяжении всех последующих промывок процедуры проводятся при слабом освещении для предотвращения фотоокисления. На следующий день предметные стекла извлекают из камеры гибридизации и помещают в банку Копленда с первым промывочным раствором, предварительно нагретым до 53 °C.
Стекла оставляют в стакане Копленда примерно на одну минуту, пока лифтер-полоски не отслоятся, после чего стекла аккуратно извлекают пинцетом и помещают в кассету для предметных стекол для проведения промывки. Затем стекла энергично погружают примерно 15–20 раз во второй контейнер, также содержащий промывочный раствор №1 при 53 °C. После этого контейнер закрывают парафильмом и помещают в инкубатор-шейкер, установленный на 53 °C и 100 RPM.
После 10-минутной инкубации и промывки промывочным раствором №1 предметные стекла интенсивно погружают 15–20 раз в контейнер с промывочным раствором №2, находящимся при комнатной температуре. Контейнер закрывают парафильмом и снова помещают на шейкер при комнатной температуре для инкубации в течение 10 минут. В завершение предметные стекла извлекают из промывочного раствора №2 и интенсивно погружают 15–20 раз в контейнер с промывочным раствором №3.
Затем стекла переносят во второй контейнер с промывочным раствором номер три, накрытым парафильмом, и снова помещают на шейкер на 10 минут. После финальной промывки мы центрифугируем стекла до полного высыхания. Для этого мы помещаем колпачок от пробирки Falcon объемом 15 мл в коническую пробирку объемом 50 мл, а затем помещаем массивы в коническую пробирку штрих-кодом вниз.
Затем пробирки центрифугируют в роторе с качающимися стаканами при 1500 RPM при комнатной температуре. После центрифугирования предметные стекла переносят во второй набор конических пробирок объемом 50 мл, которые предварительно обернули алюминиевой фольгой. Затем содержимое пробирок продувают газообразным азотом, прошедшим через фильтр 0,22 микрон, после чего пробирки закрывают крышками для транспортировки или хранения до начала сканирования.
Сбор данных сканирования осуществляется на сканере PerkinElmer scan array 5, 000. Изображение массива подвергается сеточной разметке, обработка первичных данных сканирования и их первоначальный анализ проводятся с помощью программного комплекса для обработки изображений Bio Discovery. Затем данные об интенсивности сигнала в пятнах нормализуются, а статистический анализ выполняется с использованием BRB array tools — надежного и бесплатного статистического пакета для анализа микрочипов, доступного для скачивания из Национального института рака.
Другой статистический анализ и поиск паттернов экспрессии генов выполняются с помощью пакета анализа и паттернов экспрессии генов Jeep PPAs — еще одного бесплатного веб-пакета для анализа. Благодарим за просмотр нашего видео о том, как обрабатывать микрочипы lob lolly pine PT Gen two.
Следующие лица отвечали за содержание и производство данного обучающего видео.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен микроматричный анализ кДНК PtGen2, разработанный для исследования экспрессии генов у сосны болотной и других видов хвойных. В ней подробно описаны методы подготовки и обработки образцов до и после гибридизации, а также методики промывки, позволяющие повысить воспроизводимость результатов и сократить количество артефактов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Анализ экспрессии генов
- Технология микрочипов
- Биология растений
Теоретическая часть
- микрочипы на основе кДНК незаменимы для изучения экспрессии генов.
- PtGen2 специально разработан для сосны лабзельвы и хвойных растений.
- Правильные методы обращения с образцами имеют решающее значение для получения достоверных результатов.
- Высокое содержание солей в буфере для нанесения требует предварительной промывки.
Цель исследования
- Для повышения согласованности данных экспрессии генов.
- Для снижения уровня фонового шума в результатах микрочипового анализа.
- Для предоставления исследователям стандартизированного протокола.
Используемые методы
- Предварительная промывка для удаления соли из буфера для нанесения проб.
- Методы строгого отмывания после гибридизации.
- Сравнение с протоколами из признанных исследовательских центров.
- Оценка качества сигнала и уровней фонового шума.
Основные результаты
- Наблюдалось повышение стабильности качества сигнала.
- Благодаря усовершенствованным методам удалось добиться более низкого уровня фона.
- Протоколы продемонстрировали свою эффективность в нескольких экспериментах.
- Предложены рекомендации для будущих исследований.
Выводы
- Улучшенные методы обращения с образцами и промывки имеют решающее значение для успешного проведения микрочипового анализа.
- Стандартизированные протоколы позволяют получить более достоверные данные об экспрессии генов.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для достижения более точных показателей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол решает ключевую проблему геномики растений: получение воспроизводимых данных микроматричного анализа, несмотря на использование высокосолевых буферов для нанесения проб, которые могут приводить к возникновению артефактов. Благодаря стандартизации этапов промывки до и после гибридизации, данный метод повышает согласованность данных и снижает уровень фонового шума, что обеспечивает надежное профилирование экспрессии генов у видов хвойных. Это способствует валидации мишеней в биотехнологии лесного хозяйства, позволяя более четко выявлять дифференциально экспрессируемые гены в экспериментальных условиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать транскрипционный ответ в тканях хвойных растений, что способствует проверке гипотез о путях развития или реакции на стресс.
- Практическая ценность: снижает техническую вариабельность, вызванную артефактами солевого осадка, что повышает достоверность идентификации целевых молекул.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные микрочиповые предметные стекла с низким уровнем фонового сигнала, подходящие для воспроизводимой гибридизации в различных экспериментальных группах.
- Практическая ценность: устанавливает надежный рабочий процесс подготовки стекол, который повышает воспроизводимость и масштабируемость анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Способствует снижению неопределенности механизмов путем получения надежных профилей экспрессии из тканей сосны, что полезно при изучении адаптации к окружающей среде или формирования древесины.
- Практическая ценность: Обеспечивает сопоставимость различных исследований за счет согласованной обработки срезов, способствуя непрерывности трансляционного анализа.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в рабочий процесс биологических исследований (discovery biology), в частности, обеспечивая надежное профилирование мишеней в немодельных системах растений, где возможности генетического инструментария ограничены.
- Открывающая биология: позволяет проводить анализ экспрессии на основе выдвинутых гипотез у сосны южной, уточняя гены-ответы в тканях корня, хвои и стебля.
- Скрининг: обеспечивает получение микрочипов с однородным качеством сигнала, что позволяет проводить надежный сравнительный скрининг экспрессии генов при различных условиях.
- Аналитика: генерирует чистые, нормализованные данные об интенсивности сигнала, совместимые с такими инструментами последующей обработки, как BRB Array Tools и JePPAs, для статистического анализа.
- Трансляционные исследования: поддерживает преемственность от открытия гена до функциональной валидации, предоставляя достоверные базовые показатели экспрессии.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает воспроизводимый протокол подготовки слайдов, который может быть применен для различных видов хвойных и различных планов экспериментов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при измерении экспрессии генов за счет минимизации артефактов, вызванных присутствием солей и SDS.
- Практическая ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость результатов между образцами и лабораториями благодаря четко определенным этапам промывки и обработки.
- Стратегическая ценность: Снижает риск получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов при профилировании экспрессии, что способствует принятию более обоснованных решений о целесообразности дальнейшей валидации мишеней.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию генов-кандидатов с учетом рисков на основе более чистых и надежных данных об экспрессии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микрочипами и методами гибридизации.
- Необходим доступ к водяным баням с регулируемой температурой, инкубаторам и центрифугам для обработки предметных стекол.
- Требуются стандартизированные реагенты, включая SDS, SSC, BSA и изопропанол для промывки и обезвоживания.
- Необходима адаптация контроля влажности и времени гибридизации в зависимости от источника целевой RNA и метода мечения.
- Практическое ограничение: использование буфера для нанесения проб с высоким содержанием солей требует тщательной предварительной промывки; при сокращении этапов может произойти неполное удаление солей.
