Antifouling самоорганизующихся монослоев на микроэлектродов для структурирования биомолекул

Данная процедура начинается с изготовления микроэлектрода на силиконовой подложке. Чтобы предотвратить загрязнение микротрубочек, на микроэлектроде и подложке формируется самоорганизующийся монослой полиэтиленгликоля. Затем подготавливаются микротрубочки, меченные рубином.

Наконец, микротрубочки наносятся на функционализированные электроды с помощью электрофореза. Здравствуйте, я Джон Ноэль из лаборатории Нана факультета физики и из лаборатории молекулярной биомеханики факультета биомедицинской инженерии Техасского университета A&M. Я Уилфрид Теза с факультета физики и директор Центра науки и технологий в области навыков Техасского университета A&M.

Меня зовут Хуан Куанг, я директор Лаборатории молекулярной биомеханики кафедры биомедицинской инженерии Техасского университета A&M. Сегодня мы продемонстрируем процедуру изготовления микроэлектродов, покрытых неспецифически несорбирующим самособирающимся монослоем. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения электрофоретического движения микротрубочек.

Итак, приступим. Для начала с помощью разметчика или резака для пластин разрежьте кремниевые пластины на фрагменты размером 1 см на 1,5 см, которые будут использоваться в качестве подложек. Теперь очистите подложки, поместив их в стакан с достаточным количеством ацетона, чтобы полностью покрыть их, и обработайте ультразвуком в течение пяти минут, не допуская высыхания подложек.

Промойте их в свежем ацетоне, затем сразу же повторно промойте в изопропаноле и высушите потоком азота. С помощью стандартной фотолитографии с позитивным тоном или электронно-лучевой литографии нанесите золотые микроэлектроды на очищенные подложки. При проектировании геометрии рисунка поддерживайте диаметр каждого электрода в пределах 100 мкм. Чтобы обеспечить покрытие самособирающимся монослоем полиэтиленгликольтриметоксисилана (peg Sam), предусмотрите контактные площадки, расположенные на расстоянии 300–500 мкм от рисунка, с соединительной линией длиной один миллиметр между площадкой и электродом.

После формирования рисунка в резистном слое с помощью пинцета процарапайте линию в резисте от контактной площадки до края подложки. При последующем осаждении металла эта царапина обеспечит электрический контакт между электродом и краем подложки. Для осаждения металлического слоя используется камера осаждения, предпочтительно с двумя источниками.

Электроды формируют путем осаждения 2 nm хрома с последующим нанесением 6 nm золота. Для измерения толщины пленок в процессе осаждения можно использовать кварцевые микровесы, установленные внутри камеры, без нарушения вакуума. Теперь можно приступить к подготовке самоорганизующегося монослоя в хорошо проветриваемом помещении, предварительно разогрев печь до 75 °C. Приготовьте раствор для функционализации, добавив 1 mL ПЭГ-тиола к 20 mL толуола в стеклянном стакане объемом 250 mL.

Тщательно перемешайте содержимое, перенося жидкость из пипетки в пробирку и обратно от 5 до 10 раз, а затем перемешивайте пипеткой в течение 30 секунд. Поместите образцы с нанесенным рисунком в стакан рисунком вверх, убедившись, что они полностью погружены в раствор и равномерно распределены по дну стакана. Поместите стакан в печь и выдерживайте при температуре от 18 до 21 часа до формирования SAM.

Подготовьте противоэлектрод, нанося слой хрома толщиной 1 нм, а затем слой золота толщиной 4 нм на стеклянное покровное стекло размером 22 × 50 мм. Противоэлектрод должен быть почти прозрачным с легким серым или розовым оттенком. Храните противоэлектрод в чашке Петри покрытой стороной вверх, чтобы обеспечить чистоту поверхности.

После выдерживания в печи в течение 18–21 часа извлеките стакан из печи. Толуол должен испариться, оставив образцы структуры в вязком остатке ПЭГ.

Извлеките образцы из стакана и промойте их толуолом, затем изопропанолом, и в конце высушите потоком азота. На данном этапе образцы должны выглядеть чистыми, а слой SAM должен быть невидим для невооруженного глаза. SAM, подготовленные таким образом, можно использовать в течение двух дней при хранении в прохладном сухом месте.

Неудачное формирование SAM приводит к образованию мутного или неоднородного по цвету осадка на поверхности. После подготовки SAM можно приступать к полимеризации тубулина в микротрубочки. Начните с размораживания немеченого тубулина и меченого родимином тубулина, затем немедленно смешайте их в соотношении двух частей немеченого к одной части меченого для получения ярких микротрубочек.

Тщательно перемешайте содержимое, несколько раз пропипетировав раствор. Затем полимеризуйте тубулин в течение 20–40 минут на водяной бане при 37 °C. Пока тубулин полимеризуется, приготовьте буфер с Taxol, смешав 20 µM Taxol с буфером Peps.

Тщательно перемешайте содержимое, несколько раз перенося жидкость пипеткой и используя вортекс, затем поместите пробирку в нагревательную баню при 37 °C. После полимеризации разбавьте микротрубочки в теплом буфере с Taxol и защитите их от света. Убедитесь, что полимеризация микротрубочек прошла успешно и что микротрубочки остаются стабильными в течение нескольких минут флуоресцентного возбуждения.

После визуализации подготовленных микротрубочек с использованием смеси для поглощения кислорода, когда полимеризация тубулина в микротрубочки завершена, приступим к созданию паттерна MTS с помощью электрофореза. Для начала нарежьте двусторонний скотч на узкие полоски, зафиксировав его на предметном стекле и разрезая лезвием бритвы; наклейте две полоски двустороннего скотча поперек образца с нанесенным паттерном Sam так, чтобы электрод находился между полосками, а соединительный путь проходил перпендикулярно скотчу.

Поместите вспомогательный электрод на двустороннюю клейкую ленту так, чтобы металлическая сторона касалась ленты, а край образца выступал за пределы вспомогательного электрода примерно на три миллиметра. Нарежьте несколько отрезков изолированного медного магнитного провода длиной по 15 сантиметров и снимите один сантиметр изоляции с обоих концов. С помощью небольшой капли серебряной краски прикрепите провод к открытой золотой области подложки, стараясь избежать электрического контакта со вспомогательным электродом.

Теперь с помощью серебряной краски прикрепите второй провод к противоэлектроду. Провода электродов, закрепленные серебряной краской, можно дополнительно зафиксировать на образцах с помощью клейкой ленты. Затем, используя пипетку, введите микротрубочки в нужном разведении, рассмотрите изображение при 20-кратном увеличении и найдите структуру на кремниевой пластине перед подачей напряжения.

Из-за глубины проточной камеры для визуализации ее верхней поверхности могут потребоваться объективы с большим рабочим расстоянием. Расстояние от поверхности образца до верхней поверхности проточной камеры определяется толщиной ленты и должно составлять примерно от 60 до 100 мкм. Подайте напряжение до 1 В и наблюдайте за миграцией микротрубочек.

Если требуется обратимый захват микротрубочек, используйте лак для ногтей, чтобы герметизировать проточную камеру для предотвращения бокового дрейфа, и используйте более низкое напряжение, вплоть до 0,5 вольт. Миграцию можно отслеживать, регулируя вертикальную плоскость фокусировки микроскопа; при приложенном напряжении примерно от 0,9 до 1,2 вольт микротрубочки локализуются на поверхностях электродов.

Более высокое напряжение ускорит миграцию и усилит адгезию, однако чрезмерное напряжение приведет к электролизу и деполимеризации. Микротрубочки: мы только что продемонстрировали вам способ подготовки микроэлектродов с SAM-покрытием для паттернирования микротрубочек, так как SAM-покрытие предотвращает адсорбцию микротрубочек на микроэлектродах. Данную процедуру также можно использовать для обратимого паттернирования микротрубочек.

Кроме того, этот процесс не ограничен только микротрубочками, но может быть использован и для структурирования биомолекул в целом. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.