Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования человеческих фибробластов с Stemgent правам лентивирус TF Установить

Здравствуйте, меня зовут Брэд Хэмилтон. Я ученый отдела исследований и разработок компании STEM Gen. Сегодня мы продемонстрируем процедуру перепрограммирования фибробластов человека с использованием факторов перепрограммирования, доставленных с помощью лентивируса.

Данную процедуру можно использовать как для получения ИПС-клеток, так и для изучения процесса репрограммирования. ИПС-клетки схожи с ЭСК по морфологии, пролиферации и способности дифференцироваться во все типы тканей организма. Человеческие ИПС-клетки имеют явное преимущество перед ЭСК, поскольку они обладают ключевыми свойствами ЭСК, но при этом не создают этической дилеммы, связанной с уничтожением эмбриона для получения клеток.

Получение специфических для пациента ИПСК позволяет преодолеть важное препятствие на пути к персонализированной регенеративной медицине, устраняя возможность иммунного отторжения неаутологичных трансплантированных клеток. Итак, приступим. На нескольких этапах данного протокола вам потребуется заменить среду, в которой развиваются ИПСК (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки), на кондиционированную среду.

Приготовление данной среды занимает шесть дней. Поэтому начните подготовку как минимум за неделю до планируемого начала эксперимента. Для начала засейте каждую лунку шестилуночного

Планшет с 2×10⁵ КОЕ фидерных клеток meth в 2 мл среды для роста meth инкубируют в течение ночи при 37 °C и 5% CO₂. На следующий день среду заменяют на среду для культивирования клеток human E-S-I-P-S.

Инкубируйте среду в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. Собирайте супернатант и заменяйте его свежей средой каждые 24 часа в течение четырех дней. Профильтруйте супернатант через фильтр с размером пор 0.22 µm.

Добавьте к собранному супернатанту 15 ng/mL основного фактора роста фибробластов BFGF. В итоге вы получите около 16 mL кондиционированной среды meth; храните супернатант, собранный за каждый день, отдельно при 4 °C. Кондиционированная среда meth может храниться от одной до двух недель при 4 °C или в течение нескольких месяцев при -20 °C.

Теперь, когда вы убедились, что кондиционированная среда будет готова к нужному моменту, перейдем к подготовке клеток. Первая задача при создании ИПСК — использование лентивирусов для трансдукции клеток фибробластов крайней плоти человека, или клеток BJ, четырьмя транскрипционными факторами, характерными для стволовых клеток. Чтобы подготовиться к трансдукции, высейте клетки BJ с плотностью 1 × 10⁵ клеток на лунку в 6-луночный планшет и культивируйте их.

Клетки в двух миллилитрах ростовой среды инкубируют в течение ночи при 37 °C и 5% carbon dioxide в тот же день. Начните подготовку фидерных планшетов, добавив два миллилитра 0,1% желатина, разведенного в воде, в планшет на шесть лунок, и инкубируя в течение ночи при 37 °C и 5% carbon dioxide. Желатин покрывает лунки и служит матрицей для клеток.

Теперь клетки BJ готовы к лентивирусной трансдукции. Чтобы подготовить вирус к трансдукции, добавьте к двум миллилитрам свежей среды полибренвин в концентрации 6 µg/mL и четыре вида лентивирусов, каждый из которых экспрессирует один из человеческих факторов транскрипции: Oct4, Sox2, Nanog и Lin28, таким образом, чтобы для каждого из них была обеспечена одна и та же множественность заражения (MOI).

Все эти лентивирусы входят в набор лентивирусов с факторами репрограммирования человека. Для проведения трансдукции просто замените среду для роста клеток BJ на среду, содержащую вирус. Осторожно покачайте планшет, чтобы среда равномерно покрыла дно.

Инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5% CO2 в тот же день. Извлеките один флакон фидерных клеток cf1 meth из жидкого азота и разморозьте. Удалите раствор желатина из планшетов с фидерными клетками meth, которые теперь покрыты желатином.

Добавьте 0,2 × 10⁵ клеток в 2 мл среды для роста MET. Инкубируйте смесь в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. На следующий день отделите клетки BJ с помощью 0,05% трипсина-ЭДТА и центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут.

После центрифугирования аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клетки в ростовой среде. Удалите среду из планшета с фидерными клетками meth и добавьте по два миллилитра суспензии клеток BJ в каждую лунку. Концентрация клеток BJ должна составлять примерно 5 × 10⁴ клеток на лунку.

Инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5% carbon dioxide. Через 24 часа после посева клеток BJ на плашку с фидерным слоем замените среду на среду для культивирования эмбриональных стволовых или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (human E-S-I-P-S). Продолжайте менять среду каждые 24 часа в течение семи дней.

На седьмой день замените среду для культивирования ЭСК на два миллилитра кондиционированной среды meth. Фидерные клетки meth обеспечивали soluble факторы, необходимые для роста клеток IPS. Теперь же необходимо добавить больше этих факторов, чтобы поддерживать жизнеспособность культуры.

Кондиционированная среда meth содержит все растворимые факторы, секретируемые фидерными клетками meth при инкубации в течение ночи при 37 °C и 5% carbon dioxide. С помощью микроскопа выберите колонию клеток. В новом 24-луночном планшете, в который за 24 часа до этого были высеяны фидерные клетки ccf one meth, такие колонии характеризуются видом небольшого компактного купола; перенесите выбранную колонию в культуру human E-S-I-P-S.

Среда, дополненная 10 µM молекулы Y 2 7 6 3 2. Ингибитор зависимой киназы. В течение первых семи дней каждые 24 часа заменяйте культуральную среду на среду без добавления молекулы Y 2 7 6 3 2.

Через семь дней замените среду на среду с метионином. Продолжайте пассировать клетки в данной среде до тех пор, пока они не приобретут типичную морфологию человеческих ЭСК. Обращайте внимание на небольшие компактные куполообразные колонии с четкими краями.

Колонии должны быть однородными и иметь высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение. На данном этапе вы получили колонии с морфологией ЭСК, но экспрессируют ли они гены, характерные для ЭСК? Чтобы это выяснить, окрасьте колонии на маркеры плюрипотентности, такие как TRA 1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog и SSEA-1. Для начала осторожно промойте клетки трижды с помощью PBS.

Затем зафиксируйте клетки, добавив 500 µL 4% параформальдегида или другого фиксатора, и выдержите в течение 20 минут при комнатной температуре. Через 20 минут промойте клетки с помощью PBS еще 3 раза, чтобы удалить избыток фиксатора. Далее заблокируйте неспецифическое связывание, инкубируя клетки в 500 µL блокирующего буфера на одну лунку в течение одного часа при комнатной температуре. После этапа блокировки добавьте в каждую лунку 250 µL первичных антител, разведенных в блокирующем буфере в соотношении 1:100.

Клетки инкубируют с первичными антителами в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день клетки трижды промывают PBS для удаления несвязавшихся первичных антител. Затем клетки инкубируют с 250 µL вторичных антител, разведенных 1:300 в блокирующем буфере, в течение одного часа при комнатной температуре в защищенном от света месте во избежание фотообесцвечивания после инкубации с вторичными антителами.

Трижды промойте клетки раствором PBS до третьего промывания. Добавьте DPI в концентрации 1 µg/mL для окрашивания ядер. Наконец, проанализируйте экспрессию генов ваших ИПСК.

При исследовании морфологии под микроскопом было установлено, что клетки фибробластов кожи человека, совместно трансдуцированные T four SOX two nanog и lin 28, проявляли морфологические изменения уже на четвертый день после трансдукции, а к 17-му дню клеточные кластеры стали более плотными. Для дальнейшей характеристики изолированных колоний ИПСК мы проверили наличие общих маркеров плюрипотентности, экспрессируемых в ЭСК. Колонии продемонстрировали высокую активность щелочной фосфатазы.

Кроме того, была проведена иммунохимия или ICC колоний ИПС-клеток с использованием панели специфических антител к маркерам плюрипотентности, включая поверхностные маркеры TA 180 1 TRA one 60 SSEA four и SS EEA three, а также ядерные маркеры T four, SOX two и Nanog. Изолированные колонии ИПС оказались положительными по всем маркерам. Результаты ICC показывают, что ИПС-клетки демонстрировали соответствующий паттерн экспрессии маркеров плюрипотентности, что доказывает сильное сходство этих ИПС-клеток с недифференцированными человеческими ЭС-клетками.

Мы только что продемонстрировали вам способ получения ИПСК путем перепрограммирования фибробластов человека с помощью генов стволовых клеток. Набор лентивирусов с факторами перепрограммирования человека. При выполнении данной процедуры важно учитывать несколько факторов.

Во-первых, в ходе этапа первичной трансдукции может потребоваться корректировка соотношения активного вируса к количеству целевых клеток для достижения оптимальной эффективности трансдукции. Во-вторых, влияние могут оказывать условия культивирования целевых клеток. Здоровые и пролиферирующие клетки более подвержены репрограммированию.

В-третьих, при модификации протокола для разного количества клеток рекомендуется корректировать целевое число клеток пропорционально площади поверхности культуральной чашки. Наконец, для обеспечения успешного репрограммирования следует рассмотреть применение ингибиторов ROCK, таких как Y 2 7 6 3 2, поскольку недавние исследования продемонстрировали их эффективность в повышении выживаемости колоний человеческих iPS. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.