Перепрограммирование соматических клеток человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) Использование ретровирусных вектор с GFP

Общая цель данной процедуры — получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека посредством ретровирусной опосредованной гиперэкспрессии OCT4, SOX2, KLF4 и MYC с использованием репортерной системы GFP. Это достигается путем первоначального добавления соответствующего количества отдельных ретровирусов, экспрессирующих GFP. Затем клетки, инфицированные экспрессирующим GFP вирусом, переносят в планшеты, покрытые 0,1% желатином, с эмбриональными фибробластами мыши.

Третьим этапом процедуры является замена среды на среду для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека. В завершение выделяют колонии ИПС с подавленным GFP, морфология которых схожа с морфологией эмбриональных стволовых клеток человека. В конечном итоге результаты демонстрируют экспрессию эндогенных маркеров плюрипотентности с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и R-T-Q-P-C-R.

Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как окрашивание живых клеток на плюрипотентные поверхностные маркеры и наблюдение за морфологическими изменениями, является высокая эффективность. Колонии клеток можно легко изолировать, используя потерю экспрессии GFP в качестве маркера для плюрипотентных клеток. Для начала культивирования за один день до инфицирования высейте человеческие фибробласты в среду для фибробластов: 1 × 10⁵ человеческих фибробластов в одну лунку планшета на 6 лунок. На следующий день аспирируйте среду для удаления погибших клеток и добавьте 2 мл свежей среды для фибробластов, содержащей 5 µg/mL протамина сульфата.

Затем осторожно добавьте соответствующее количество каждого вируса, экспрессирующего GFP, исходя из множественности заражения, равной пяти. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение ночи через один день после заражения. Удалите вирусную супернатант и трижды промойте клетки 2 мл PBS.

Затем через три дня после инфицирования добавьте два миллилитра среды для фибробластов. Проверьте флуоресценцию GFP и долейте в лунку два миллилитра среды для фибробластов. На следующий день высейте в чашку Петри диаметром 10 см, покрытую 0,1% желатином, облученные эмбриональные фибробласты мыши или клетки-фидер MEF в среде для фибробластов в концентрации 1 × 10⁴ на квадратный сантиметр.

Инкубируйте клетки при 37 °C в течение ночи. На следующий день отсоедините инфицированные фибробласты человека, добавив 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА, и выдержите в течение пяти минут при 37 °C, затем центрифугируйте пять минут при 200 G. Ресуспендируйте клетки в 10 мл среды для фибробластов и посейте их на предварительно покрытые 0,1% желатином поверхности через 24 часа.

Замените среду на культуральную среду для HESC и проводите смену среды ежедневно. Колонии, подобные ESC, начнут появляться через 20–27 дней после инфицирования; обнаружить их можно с помощью флуоресцентного микроскопа. Убедитесь в отсутствии флуоресценции GFP в колонии, морфология которой схожа с HSCs.

Используя пипетку на 10 мкл, перенесите отдельные колонии IPSC в одну лунку 12-луночного планшета, покрытого желатином и метоксом и заполненного средой для HESC. Ежедневно меняйте среду; для пассажа клеток промойте планшет 1 мл DMM F 12.

Затем добавьте 0,5 мл коллагеназы и инкубируйте в течение 10 минут при 37 °C. Промойте клетки дважды с помощью DM A MF 12. Далее добавьте два мл свежей среды для HESC.

Затем с помощью клеточного скрабера разбейте колонии на мелкие фрагменты и отделите оставшиеся клетки от планшета. Перенесите ресуспендированные фрагменты колоний в одну лунку шестилуночного планшета, покрытого желатином и MEF, и инкубируйте при 37 °C в течение двух дней.

Для проверки клеток методом иммунофлуоресценции промойте их трижды с помощью PBS и зафиксируйте 4% паральдегидом в течение 20 минут при комнатной температуре. Осторожно промойте клетки трижды с помощью PBS и проведите пермеабилизацию 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 30 минут.

Заблокируйте неспецифическое связывание, инкубируя клетки с 3% BSA в PBS в течение двух часов. Затем инкубируйте клетки с первичными антителами в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. После этого промойте клетки трижды с помощью PBS и инкубируйте их со вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.

Трижды промойте клетки PBS, завершив процедуру последней промывкой. Добавьте dappy и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Получите изображения клеток с помощью флуоресцентного микроскопа для количественного анализа в режиме реального времени.

Выделите общую РНК из человеческих IPC, полученных из фибробластов человека, с помощью набора для выделения РНК. Синтезируйте первую цепь кДНК с использованием обратной транскриптазы.

Затем используйте полученный продукт в качестве матрицы для количественной ПЦР (кПЦР) с целью детекции генов плюрипотентности. Здесь представлены морфологические изменения, наблюдаемые в процессе репрограммирования человеческих фибробластов линии BJ, инфицированных коктейлем ретровирусов, несущих OCT4, SOX2, KLF4 и MYC, начиная с пятого дня. На 10-й, 14-й и 21-й дни клетки начинают приобретать морфологию, характерную для эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), а индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) определяются по флуоресценции GFP.

Плюрипотентные стволовые клетки, такие как ESCs и IPCs, обладают молекулярным механизмом подавления экспрессии провирусных генов. Однако ретровирусные векторы, используемые в данной работе, экспрессируют GFP совместно с генами репрограммирования под управлением ретровирусного LTR. Таким образом, клетки, которые непрерывно экспрессируют GFP, считаются экспрессирующими трансгены без сайленсинга провирусных генов. Как видно здесь, в достоверно репрограммированных колониях IPSC, которые приобретают молекулярную сеть плюрипотентности, наблюдается отсутствие экспрессии GFP.

На этом рисунке показан иммуногистохимический анализ колоний, полученных из фибробластов Detroit 5 51, с использованием антител к TRA 180 1, TRA one 60, SSEA four, T four и nano, что свидетельствует об успешности процедуры. Перепрограммированные ИПК экспрессируют все эти маркеры. Кроме того, была проведена количественная ОТ-ПЦР для анализа экспрессии генов, которая выявила, что уровни T four, SOX two, KLF four M и nano были значительно повышены по сравнению с родительскими фибробластами, но соответствовали показателям H nine HSCs.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как инфицировать клетки вирусом, а также идентифицировать и отбирать полностью липопрограммированные клетки IPA с помощью флуоресцентной микроскопии.