Адгезии тромбоцитов и статистические Под потоком использованием микрожидкостных Клетки потока

Система BioFlux представляет собой автоматизированный прибор и микрофлюидное устройство для проведения анализов живых клеток в условиях контролируемого сдвигового потока. В данной системе используется микрофлюидная технология многолуночных планшетов для интеграции проточных ячеек микронного масштаба в стандартные планшеты SBS. BioFlex может применяться для высокопроизводительного изучения адгезии и агрегации тромбоцитов с использованием малых объемов крови.

Цельная кровь, меченная флуоресцентным красителем, добавляется в лунки, после чего она прокачивается через каналы. В условиях контролируемого сдвигового потока получаются микроскопические данные высокого разрешения, которые позволяют количественно оценить адгезию и агрегацию тромбоцитов в присутствии лекарственных соединений и при других варьируемых параметрах. Здравствуйте, я Майк Шварц из лаборатории R&D компании Flexion Biosciences.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру использования микрофлюидных проточных камер в анализах адгезии тромбоцитов. Мы применяем данный протокол в нашей лаборатории для различных исследований в области биологии сосудов. Итак, приступим.

Перед проведением эксперимента в проточной кювете микрофлюидные каналы планшета Bioflux необходимо подготовить, нанеся покрытие из интересующего белка; в данном эксперименте будет использован коллаген I. Каждый из 24 экспериментальных каналов планшета Bioflux соединяется с входной и выходной лунками этого планшета. Входная лунка находится слева и подает раствор в канал, а выходная лунка расположена справа; разведите стоковый раствор коллагена I до концентрации 200 µg/mL.

Для каждого используемого канала потребуется 20 µL 0,02 молярной уксусной кислоты. Поскольку в данном эксперименте используется 11 каналов, приготовьте 200 µL раствора для покрытия коллагеном. Один канал остается непокрытым; перемешивание осуществляется путем осторожного дозирования с помощью наконечника микропипетки.

С помощью микропипетки внесите по 20 µL покрытия в каждый соответствующий канал, дозируя жидкость во внутреннее отверстие лунки. Заполняя нужный микрофлюидный канал, как показано здесь с использованием желтого красителя, оставьте один канал без коллагена в качестве отрицательного контроля адгезии и агрегации тромбоцитов. После нанесения коллагенового покрытия во все соответствующие каналы закрепите интерфейс на планшете.

При использовании интерфейса bio flux 1000 зафиксируйте оба зажима на предметном столике. При использовании интерфейса Bio flux 200 сначала затяните четыре винта. После того как все винты будут установлены, полностью затяните их с помощью динамометрического ключа.

Динамометрический ключ щелкнет при достижении максимального значения. Используя ручной режим в программном обеспечении BioFlux, подайте перфузию в интересующие каналы со скоростью 2D на квадратный сантиметр от выходного отверстия. С помощью микроскопа с маломощным объективом найдите входную лунку и убедитесь, что противоположный внутренний пробой заполняется жидкостью.

Сначала вы должны увидеть крошечную струю жидкости, которая в течение нескольких минут медленно заполняет внутренний пробойник; когда внутренний пробойник на входе будет заполнен, остановите подачу во всех каналах, нажав кнопку stop в программном обеспечении. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа. В течение этого периода инкубации можно начать подготовку цельной крови, чтобы она была готова к концу одного часа инкубации.

После подготовки крови снимите интерфейс и добавьте один миллилитр PBS с ионами кальция и магния в выходную лунку. Начните перфузию из выходной лунки со скоростью 2 дн/см² и продолжайте перфузию в течение 10 минут. Через 10 минут остановите перфузию. После снятия интерфейса удалите излишки PBS как из входной, так и из выходной лунок.

Никогда не удаляйте жидкость, заполняющую внутренний пробойник. Чтобы заблокировать каналы, добавьте по 1 ml блокирующего раствора в каждое выпускное отверстие. Перфузируйте лунку, которую необходимо использовать, через выпускную лунку со скоростью 2 dl/cm² и продолжайте перфузию в течение 10 минут.

Остановите перфузию через 10 минут и удалите интерфейс. Теперь каналы готовы и могут использоваться в течение дня, пока планшет покрывается коллагеном. Во время одночасовой инкубации следует подготовить свежую кровь человека, взятую у лица в состоянии голодания, для визуализации и подачи в планшет.

Кровь следует собирать в пробирки с цитратом натрия в качестве антикоагулянта и использовать в течение трех часов после забора. Сначала добавьте к крови стоковый раствор кальция M в DMSO с концентрацией 4 mM в разведении 1:1000 по объему. Для получения концентрации 4 µM кальция смесь перемешивают путем осторожного переворачивания пробирки.

Затем разлейте по 1 mL крови, меченной кальцием, в десять микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 mL. В каждую пробирку добавьте ингибирующее антитело GP two B three в нужном разведении. Обязательно включите отрицательный контроль без антитела и положительный контроль с нерелевантным антителом, перемешивая содержимое путем осторожного переворачивания пробирок.

Инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение одного часа, осторожно перемешивая содержимое путем переворачивания каждые 10 минут перед началом эксперимента в проточной кювете. В модуле управления BioFlux должен быть настроен автоматизированный протокол для коллагена. Один. Настройте протокол для подачи крови со скоростью десять девять сантиметров squared в течение 10 минут из выходного отверстия.

При использовании рабочей станции BioFlex 1000 необходимо настроить параметры сбора данных, которые включают желаемое положение предметного столика, длину волны захвата и настройки таймлапса. Типичный план сбора изображений для данного протокола включает один обзорный вид на канал, захватываемый с помощью объектива 10x каждые 30 секунд в течение общего времени 10 минут. Также возможен выбор дополнительных обзорных видов и альтернативных настроек TimeLapse.

После настройки автоматизированного протокола и параметров сбора данных вернитесь к планшету BioFlex и удалите жидкость с обеих сторон канала, за исключением внутренних отверстий. Действуя быстро, внесите по 500 µL крови для каждого условия в выходные лунки каждого канала. Обратите внимание, что выходные лунки используются для подачи крови, так как это кратчайший путь к зоне наблюдения, что обеспечит более быструю реакцию крови на коллагеновое покрытие.

Кроме того, поместите контрольную кровь без антител в канал, покрытый коллагеном, и в канал, который был только блокирован. Установите планшет на микроскоп рабочей станции BioFlex 1000 и закрепите его в интерфейсе. Выполните калибровку списка позиций столика, определив первую точку калибровки, которая принимается за начало координат.

Затем найдите и отметьте вторую точку калибровки. Примените эту калибровку к соответствующему списку стадий. Это обеспечит автоматический поиск всех точек обзора на планшете.

Переместите предметный столик к одному из каналов, содержащих кровь. Установите параметры захвата изображения, такие как время экспозиции и усиление, в программном обеспечении BioFlex montage. Запустите соответствующий рабочий процесс, нажав нужную кнопку. Это одновременно запустит протокол потока и сбор изображений.

По окончании эксперимента извлеките планшет из рабочей станции BIOFLU 1000 и утилизируйте его в соответствии с правилами вашего учреждения. В микрофлюидных каналах системы bio flux, покрытых коллагеном, в контрольном образце необработанной крови с течением времени наблюдается интенсивное формирование тромбов.

Напротив, в канале без покрытия образование тромбов не наблюдается. В одном из недавно проведенных экспериментов средний размер агрегатов в контрольных условиях составил 2000 micrometer squared. GP IIbβ3a является мощным медиатором взаимодействия тромбоцитов и стабилизации агрегации при активации путем адгезии к коллагену; как показано здесь, после инкубации с антителами к GP IIbβ3a в течение одного часа перед воздействием сдвига наблюдается уменьшение размера тромбов, а также снижение частоты образования тромбов.

Обычно наблюдается дозозависимый ответ при 10 дин/см², а значение IC₅₀ для данного ингибитора составило 17 нМ. Максимальное ингибирование для этого донора по сравнению с контролем без антител составило 11% при 10 дин/см². Для проведения экспериментов с цельной кровью при высоком сдвиге до 200 дин/см² или 5 000 с⁻¹ также доступен 48-луночный планшет для высокого сдвига.

Мы только что продемонстрировали вам, как использовать микрофлюидные проточные каналы для проведения физиологически релевантных экспериментов в области биологии сосудов. При выполнении данного протокола важно помнить о необходимости разведения коллагена в соответствующем буфере. Всегда используйте правильную технику пипетирования, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха, и строго соблюдайте правила биологической безопасности вашей лаборатории.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.