Мозаика данио рерио трансгенез для оценки Enhancer Последовательности

Здравствуйте, я Эрика Кги из лаборатории Шеннон Фишер на кафедре клеточной и биологии развития Пенсильванского университета. Я Крис Вебер, также из лаборатории Фишер. И я Шеннон Фишер.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа функции энхансерных элементов с помощью трансгенеза у zebrafish. Мы используем этот метод для изучения транскрипционной регуляции генов, имеющих важное значение для развития скелета. Итак, приступим.

Для идентификации некодирующих последовательностей, окружающих гены-кандидаты, мы используем алгоритм fast cons, который доступен в виде трека в браузере генома uc SC. В первую очередь нас интересуют гены, экспрессируемые в процессе развития скелета, однако этот же подход можно использовать для изучения любых генов, экспрессируемых на ранних стадиях развития. В приведенном здесь примере мы идентифицировали консервативные последовательности.

В интервале вокруг человеческого гена bumper мы исследуем весь участок до соседних генов и определяем низкий порог логарифмического балла для конкретного размера, соответствующий примерно верхним 5% некодирующей последовательности. После выбора последовательностей с помощью программы Primer3 разработайте праймеры для амплификации каждой последовательности из геномной ДНК человека; праймеры следует подобрать таким образом, чтобы амплифицировать консервативный регион плюс 30 или более пар оснований с каждой стороны. Амплифицируйте интересующий регион с использованием высококачественной полимеразы и геномной ДНК человека, затем примените стандартные лабораторные методы молекулярной биологии для клонирования амплифицированного продукта в экспрессионный вектор.

В данном протоколе используется вектор PG wc FOS GFPA gateway. Вектор-реципиент. После создания вектора следует выполнить транспозицию.

Фермент, необходимый для транспозиции, сначала транскрибируют in vitro с использованием набора M message M machine от Ambion и плазмиды PGB 600 перед проведением экспериментальных инъекций. Каждую партию транспозаз следует протестировать на эффективность, проведя инъекцию с известным энхансером, таким как mouse socks. 10 enhancer.

Для подготовки к инъекциям вытяните иглы для микроинъекций из филаментного капиллярного стекла диаметром 1,2 мм с помощью вытягивателя микропипеток Sutter P 97. Используйте программу, которая обеспечивает создание прочного кончика с резким сужением, чтобы иметь возможность проникать через неповрежденный хорион с помощью чистого лезвия бритвы и предметного стекла с микрометром. Обломите кончики вручную под стереомикроскопом до достижения внешнего диаметра примерно 15 мкм.

Иглы можно хранить в течение одного дня в закрытой чашке для хранения. За день до проведения микроинъекций поддерживайте популяцию zebrafish в стандартных условиях с регулярным циклом свет/темнота (14 часов света).

В утро дня микроинъекций, вскоре после начала светового цикла, поместите в аквариумы по три самки или по два самца, расставив их параллельными рядами. Для получения икры поместите самцов и самок вместе в чистую системную обработанную воду. Часто проверяйте рыб и собирайте икру в течение нескольких минут после ее появления, чтобы получить хорошо синхронизированные партии.

Поддерживайте сбор икры в течение двух-трех часов, продолжая объединять новые группы рыб в течение всего утра, используя стеклянную пипетку с широким отверстием диаметром 5,25 дюйма, оснащенную латексной грушей. Распределите собранные эмбрионы по чашкам Петри размером 60×15 мм, частично заполненным средой для эмбрионов, группами по 50 эмбрионов. Укажите время сбора на крышке каждой чашки.

Из каждой собранной порции эмбрионов отберите 50 штук в отдельную чашку для использования в качестве неинъецированного контроля между сборами икринок. Приготовьте свежие растворы для инъекций, смешав следующие ингредиенты в микроцентрифужной пробирке, и храните их на льду. Поместите инъекционные иглы в чашки-держатели и заполните их от 1.5 до 2 µL раствора для инъекций.

Нанесите пипеткой капли объемом 500 nanoliter на широкий конец каждой иглы. Жидкость поднимется к кончику иглы за счет капиллярного эффекта. Подготовьте как минимум две иглы для каждого раствора для инъекций.

Поместите заполненную иглу в ручной держатель пневматического пико-насоса или аналогичного инъектора давления, настроенного и подключенного к баллону с азотом в соответствии с инструкциями производителя. Откалибруйте объемы инъекций, измерив диаметр капель, вытесненных в минеральное масло на предметном стекле с микрометрической шкалой; обычно время инъекции составляет 120 milliseconds.

При давлении 20 PS с помощью стереомикроскопа при увеличении от 6 до 10 x я получу каплю объемом примерно один нанолитр. Удерживая эмбрион тонким пинцетом, плавным и равномерным движением проколите хорион иглой для инъекций и введите её в желток эмбриона на стадии одной или ранней двухклеточной стадии; расположите кончик иглы в желтке непосредственно под бластомерами, введите примерно один нанолитр раствора для инъекции и извлеките иглу. Для каждого конструкта мы вводим раствор в ≥ 200 эмбрионов. После завершения инъекций проведите сортировку эмбрионов, удалив неоплодотворенные яйца, поврежденные эмбрионы, случаи неудачных инъекций или эмбрионы, в бластомерах которых отсутствует феноловый красный.

Затем мы инкубируем эмбрионы и среду для эмбрионов при 28.5 °C до наступления подходящего времени для наблюдений. Теперь мы продемонстрируем некоторые репрезентативные результаты работы элементов энхансеров, которые создают тканеспецифичные паттерны экспрессии GFP в эмбрионе zebrafish. Мы изучаем гены, экспрессируемые в костной или хрящевой ткани в течение.

Ниже приведен пример элемента-энхансера, расположенного выше гена acan, который регулирует экспрессию в хрящевой ткани черепно-лицевого отдела на третий день после оплодотворения. Здесь представлен другой энхансер, на этот раз гена bumper, который регулирует экспрессию в клетках костной ткани. На пятый день, анализируя множество выявленных нами энхансеров, мы обнаруживаем слабую корреляцию между их расположением относительно гена и регуляцией экспрессии.

При выборе последовательностей для тестирования важно помнить, что энхансер может находиться за сотни килобаз выше или ниже гена или в одном из интронов, как видно на данном эмбрионе. Значительная часть последовательностей, по всей видимости, не регулирует тканеспецифическую экспрессию. В таких случаях часто наблюдается очень слабая флуоресценция или наличие нескольких разрозненных клеток в двух типичных местах эктопической экспрессии: в эпидермисе и скелетных мышцах.

Мы только что продемонстрировали, как идентифицировать потенциальные элементы энхансеров с помощью анализа консервативности последовательностей и проверить их функцию с помощью мозаичного трансгенеза у zebrafish. При выполнении данной процедуры важно проверить качество ДНК и РНК, используемых для инъекций. Также обязательно тщательно осмотрите все инъецированные эмбрионы, особенно если экспрессия ожидается только в небольшой группе клеток.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.