Идентификация фенотипов ингибирование роста индуцированной экспрессии бактериального типа создания эффектов III в Дрожжи

Для начала выполнения данного протокола выберите вектор для экспрессии интересующего вас бактериального эффектора. В случае использования дрожжей и конкретного штамма дрожжей вектор трансформируют в дрожжевые клетки. Затем индуцируют экспрессию эффектора.

Индуцированные клетки лизируют для последующего вестерн-блот-анализа с целью подтверждения экспрессии эффектора. После подтверждения экспрессии эффектора клетки выращивают, и их десятикратные серийные разведения наносят на репрессирующую и индуцирующую среды. Наконец, через два-три дня анализируют рост дрожжей.

Здравствуйте, я До Соломон из лаборатории доктора Гвидо Чеза с кафедры растениеводства Тель-Авивского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру идентификации фенотипов ингибирования роста, индуцированных экспрессией бактериальных эффекторов третьего типа в дрожжах. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения функций эффекторов третьего типа грамотрицательных патогенных бактерий; данный метод помогает нам в идентификации мишеней эффектора TIC.

Приступим к работе. При разработке дрожжевой системы, подходящей для экспрессии интересующих эффекторов третьего типа, необходимо учитывать и оптимизировать несколько важных факторов. Первый из них — промотор, обеспечивающий экспрессию эффекторов.

Поскольку бактериальные эффекторы третьего типа могут быть токсичны для клеток дрожжей, для контроля их экспрессии следует использовать индуцибельный промотор. В данном эксперименте мы будем использовать промотор GAL1. Вторым фактором является число копий гена эффектора.

Высокие уровни экспрессии достигаются, когда эффекторный ген переносится двухмикронной плазмидой. Средний уровень экспрессии достигается при использовании плазмиды, содержащей центромеру, а низкий уровень — при интеграции эффекторного гена в геном дрожжей посредством гомологичной рекомбинации. Третьим фактором, который следует учитывать, является эпитопная метка, используемая для подтверждения экспрессии белка в тех случаях, когда антитела к интересующему эффектору недоступны.

Обычно используются теги M-гемагглютинин HA или flag, для которых доступны надежные коммерческие антитела. Мы рекомендуем использовать только одну копию тега, чтобы свести к минимуму нежелательные вредные воздействия на структуру и активность эффекторного белка. И наконец, штамм дрожжей, используемый для экспрессии, должен быть чувствителен к селективному маркеру экспрессионного вектора.

Для выращивания клеток дрожжей для трансформации возьмите колонию дрожжей с свежей чашки и инокулируйте три миллилитра YPD в 15-миллилитровой полипропиленовой пробирке, перемешав на вортексе. Кратковременно поместите пробирку с культурой в роллер и инкубируйте в течение ночи при 30 °C при постоянном вращении. На следующее утро извлеките культуру из роллера и центрифугируйте при 800 G в течение пяти минут при комнатной температуре.

После центрифугирования полностью удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре буфера для ресуспендирования Resus, перемешивая на вортексе на максимальной скорости в течение примерно 10 секунд. Для каждой плазмиды, подлежащей трансформации, а также для дополнительного контрольного образца, перенесите 100 µL клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку. В каждую пробирку, кроме контрольной, добавьте пять µL одноцепочечной ДНК спермы лосося и от 250 до 500 ng плазмидной ДНК.

Затем аккуратно добавьте по 650 µL раствора для трансформации в каждую пробирку и перемешайте на вортексе. Инкубируйте пробирки при 30 °C в течение 30 минут на ротационном смесителе. По завершении инкубации добавьте по 70 µL DMSO в каждую пробирку и перемешайте, перевернув пробирки 10–15 раз, чтобы избежать разрушения клеток.

Не подвергайте пробирки вортексу. Поместите пробирки в предварительно нагретую до 42 °C водяную баню и инкубируйте в течение 15 минут. По истечении 15 минут извлеките пробирки из водяной бани и немедленно поместите их на лед на две минуты.

После охлаждения пробирок соберите клетки путем центрифугирования, затем с помощью дозатора осторожно удалите вязкий супернатант. Ресуспендируйте каждый осадок в 150 µL стерильной дважды дистиллированной воды и распределите клеточную суспензию по чашкам с соответствующей селективной средой. Оставьте чашки открытыми на две минуты для подсушивания в ламинарном шкафу.

После этого поместите чашки в инкубатор при 30 °C на два-три дня для выращивания дрожжевых клеток. Для подготовки белкового экстракта инокулируйте 3 мл соответствующей репрессирующей среды колонией дрожжей со свежей чашки и перемешайте на вортексе. На следующий день поместите пробирку с культурой в роллер при 30 °C на короткое время.

Снимите культуру с роллера и центрифугируйте при 800 Gs в течение пяти минут при комнатной температуре, удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок. В трех миллилитрах стерильной DDW перемешайте суспензию с помощью вортекса и снова центрифугируйте, удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в трех миллилитрах стерильной DDW. Затем перенесите 200 мкл клеточной суспензии в новую пробирку объемом 15 мл, содержащую три миллилитра соответствующей индуцирующей среды, предварительно перемешанной с помощью вортекса.

Поместите пробирку в роллер и инкубируйте в течение ночи при 30 °C. На следующее утро перенесите один миллилитр культуры (или больше, если плотность культуры низкая) в микроцентрифужную пробирку. Соберите клетки путем центрифугирования при 800 G в течение пяти минут при комнатной температуре; далее работайте в вытяжном шкафу, чтобы избежать вдыхания токсичных паров этанола Beamer capto.

Осторожно удалите супернатант с помощью пипетора и ресуспендируйте клеточный осадок в 100 µL ледяного лизирующего раствора. Тщательно перемешайте на вортексе и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Во время 30-минутной инкубации определите объем нормализованной соляной кислоты, необходимый для титрования 100 µL лизирующего буфера до pH 9–10.

Для этого добавьте разные объемы соляной кислоты в 100 µL лизирующего буфера в 10 разных пробирках и проверьте pH раствора с помощью pH-индикационной полоски в конце инкубации при соответствующем объеме соляной кислоты в лизате, затем перемешайте на вортексе. Затем добавьте 50 µL трехкратного буфера для образцов в лизат и перемешайте на вортексе, проколите иглой крышку микроцентрифужной пробирки и кипятите раствор лизата на нагревательном блоке в течение пяти минут. После кипячения дайте раствору остыть в течение двух минут при комнатной температуре.

Затем перемешайте раствор лизата на вортексе и центрифугируйте его в течение 10 секунд. Теперь лизат готов к иммуноанализу крови для подготовки клеток к проведению анализа методом капельного нанесения (spotting assay). На следующий день вырастите культуры каждого штамма объемом по три миллилитра, как было показано ранее.

Подготовьте две чашки с синтетической полноценной средой без лейцина. Среду в одной чашке следует дополнить 2% glucose, а в другой — 2% acctose и 1% raffinose. Высушите чашки в стерильном ламинарном шкафу при комнатной температуре в течение 20 минут.

Соберите клетки и ресуспендируйте каждый клеточный осадок в трех миллилитрах стерильной DDW. Повторите этап центрифугирования и снова ресуспендируйте клетки в трех миллилитрах стерильной DDW. Определите оптическую плотность или OD каждой культуры, затем приготовьте в стерильных микроцентрифужных пробирках суспензии клеток объемом один миллилитр с OD 600, равной одному.

Затем приготовьте три десятикратных серийных разведений для каждой из клеточных суспензий, используя три стерильные микропробирки, заполненные 900 µL стерильной деионизированной воды (DDW). Поместите сухие чашки на сетку и нанесите в ряд по 10 µL из четырех разведений для каждой культуры. После нанесения оставьте чашки открытыми в ламинарном шкафу на несколько минут.

Когда пятна высохнут, накройте планшеты и поместите их в инкубатор при 30 °C на два-три дня. Теперь мы продемонстрируем результаты анализа точечного посева дрожжей для обнаружения ингибирования роста. Фенотипы, индуцированные экспрессией эффекторов третьего типа — в данном случае эффекторов третьего типа AvrPto, HopAA1 и AvrRe1 данной бактерии.

Белки Pseudomonas Riner, поражающие томаты, экспрессировали из центромерной плазмиды в штамме дрожжей на репрессивной среде; штаммы дрожжей, несущие плазмиды для экспрессии A-V-R-P-T-O и HOP AA one one, демонстрировали рост, аналогичный контрольному штамму с пустым вектором. В то время как дрожжи, несущие AAV RE one, показали несколько сниженный рост, вероятно, из-за утечки промотора GAL one и высокой цитотоксичности AV RE one, в условиях индуцирования экспрессия либо AV E one, либо HOP AA one one вызывала резкое подавление роста, что выражалось в отсутствии колоний при любом разведении. Напротив, экспрессия A-V-R-P-T-O не оказывала никакого ингибирующего эффекта на рост.

Мы только что продемонстрировали вам, как определять фенотипы ингибирования роста, вызванные экспрессией бактериальных эффекторов третьего типа в дрожжах. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательного выбора экспрессионного вектора, а также штамма, так как оба этих фактора могут существенно повлиять на результаты. Кроме того, на всех этапах процедуры используйте свежетрансформированные колонии.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.