Разработка автоматизированной обработки изображений и анализа для экранов данио химических веществ.

В данном видео демонстрируется проведение высокопроизводительного скрининга на основе анализа изображений для оценки модуляции пути MAPK-киназы фактора роста фибробластов малыми молекулами. Для этого трансгенных самцов и самок дикого типа данио-рерио скрещивают в нерестовой клетке. Оплодотворенные икринки оседают на дно, где их собирают и переносят в чашку Петри. Эмбрионы инкубируют в течение ночи, после чего помещают в отдельные лунки 96-луночного планшета с круглым дном.

Малая молекула BCI добавляется для гиперактивации сигналинга FGF, после чего планшет инкубируют в течение шести часов. С каждого планшета снимают изображения с помощью конфокального планшетного ридера и анализируют их с использованием специально разработанного алгоритма, который определяет интенсивность флуоресценции в конкретных эмбриональных структурах. Здравствуйте, меня зовут Хиба Кадо, я из лаборатории доктора Майкла Чанга на кафедре микробиологии и молекулярной генетики Питтсбургского университета.

Здравствуйте, я Андреа Спок из Института разработки лекарственных препаратов Питтсбургского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру разведения, отбора и размещения эмбрионов zebrafish для химической обработки. В 96-луночной планшете мы будем использовать трансгенные эмбрионы-репортеры активности фактора роста фибробластов, обработанные молекулой, которая гиперактивирует этот путь.

Мы продемонстрируем, как использовать методику высокопроизводительного скрининга для автоматического получения, анализа и количественного определения активности фактора роста фибробластов в эмбрионах трансгенных данио-рерио. В данной процедуре будет освещена технологическая платформа по использованию трансгенных данио-рерио и высокопроизводительного химического скрининга. Итак, приступим.

За два дня до начала обработки отберите гомозиготных трансгенных самцов данио-рерио и поместите их в индивидуальные нерестовые аквариумы. Установите в аквариумы перегородки, затем добавьте в каждый аквариум самку дикого типа и оставьте рыб в нерестовых клетках на ночь при температуре 28 °C. На следующее утро удалите перегородку. Через один час перенесите рыб в новый аквариум, а эмбрионы перелейте через пластическое сито.

Перенесите эмбрионы в чашки диаметром 100 мм с раствором E3 и инкубируйте при 28 °C в течение шести-восьми часов. После инкубации осмотрите эмбрионы под стереомикроскопом. Для экспериментов подходят эмбрионы на стадии гаструляции.

На этом этапе удалите все неоплодотворенные эмбрионы, которые остаются на стадии одной клетки. Также удалите нежизнеспособные эмбрионы, которые выглядят непрозрачными или имеют деформации. Затем добавьте свежий раствор E three и инкубируйте в течение ночи при 28 °C.

На следующий день поместите эмбрионы под флуоресцентный стереомикроскоп, чтобы отобрать трансгенные эмбрионы на одной стадии развития и с однородной экспрессией GFP. У эмбрионов через 24 HPF видна граница среднего мозга и заднего мозга с интенсивной экспрессией GFP, а также сформированные глаза с GFP-положительными дорсальными сетчатками. Эти эмбрионы активны, они двигаются и извиваются в хорионе; для их перемещения используйте пластическую пастер-пипетку.

Перенесите эмбрионы в возрасте 24 HPF по одному в отдельные лунки 96-луночного планшета. С помощью микропипетки удалите из лунок излишки раствора E three. Затем с помощью многоканального дозатора добавьте в каждую лунку 200 microliters раствора E three.

Затем добавьте по 2 µL DMSO во все лунки в столбцах 1 и 12. После этого добавьте по 2 µL BCL, приготовленного в DMSO, следующим образом: 1 µM в столбцы 2 и 7; 5 µM в столбцы 3 и 8; 10 µM в столбцы 4 и 9; 20 µM в столбцы 5 и 10.

Добавьте 25 мкМ в колонки шесть и 11. Теперь накройте планшет алюминиевой фольгой и инкубируйте в течение шести часов при 28 °C.

Добавьте по 10 µL трикаина в каждую лунку, чтобы анестезировать эмбрионы на стадии 30 HPF. Затем поместите планшет в систему Molecular Devices ImageXpress Ultra с запущенным программным обеспечением Meta Express. Выберите конфигурацию с 40x объективом и максимальным диаметром пинхола.

Настройте автофокусировку лазера для обнаружения дна планшета и используйте заранее определенное оптимальное смещение по оси Z. Для обнаружения интересующих областей установите область сканирования как один участок размером 2000 на 2000 пикселей без биннинга. Выберите соответствующий тип планшета и аргоновый лазер с длиной волны 488 нм при длинах волн возбуждения и эмиссии 488 и 525 нм соответственно.

Затем выберите лунку с эмбрионом, подвергнутым воздействию контрольного раствора (vehicle), и нажмите «find sample». Прибор выполнит сканирование для автоматической фокусировки и получит одно изображение для подтверждения правильности захвата изображения. Произвольно выберите лунку с контрольным раствором и получите изображение.

Если изображение сфокусировано и наблюдается экспрессия GFP в голове, поместите курсор над самыми яркими областями и убедитесь, что интенсивность флуоресценции находится в пределах диапазона 16-битной камеры: менее 65 000 единиц.

Повторите эти шаги с еще одним контролем с носителем и несколькими лунками, обработанными соединением. При необходимости отрегулируйте мощность лазера и усиление так, чтобы самые яркие области на изображениях положительного контроля не были перенасыщены. Затем в окне сбора данных и управления планшетом выберите «acquire plate», чтобы начать сканирование планшета.

Прибор автоматически получит по одному изображению для каждой лунки всего микропланшета и заархивирует их в базе данных SQL-сервера. После завершения сканирования загрузите изображения в D definition's. Developer, открыв Developer с включенной опцией slinger.

Создайте новое рабочее пространство. Затем в меню «Файл» (file) выберите «Настраиваемый импорт» (customized import). Далее перейдите в папку с изображениями и откройте образец файла.

Выберите фильтр импорта, который распознает формат изображений и структуру файлов, созданных на платформе Molecular Devices ImageXpress Ultra. Теперь для обработки изображений откройте контрольное изображение и загрузите соответствующую технологию когнитивных сетей (CNT), алгоритм или набор правил. Используемый здесь пользовательский алгоритм предназначен для автоматического определения эмбриона, желтка и головы, а также для количественного анализа яркости и площади экспрессирующих GFP структур головы; примените набор правил до этапа обнаружения головы и желтка.

Для обеспечения правильного определения желточного мешка и головы измените набор правил, чтобы скорректировать порог обнаружения желтка, если он слишком велик или слишком мал. Затем выполните набор правил до этапа обнаружения ярких структур головы. Чтобы обеспечить правильное определение областей экспрессии GFP в голове, измените набор правил, регулируя порог обнаружения структур головы как кратное средней интенсивности, пока результаты обнаружения ярких структур головы не совпадут с данными визуального наблюдения.

Затем вручную примените весь набор правил к нескольким случайно выбранным изображениям, полученным от эмбрионов, подвергшихся воздействию контрольного вещества, и к изображениям положительного контроля от эмбрионов, подвергшихся воздействию PCI. Чтобы запустить алгоритм для всех изображений планшета, выберите планшеты для анализа и нажмите Analyze, после чего перейдите к оптимизированному набору правил и проведите анализ всех лунок.

Благодаря интегрированному планировщику задач пустые лунки или неоднозначные изображения будут автоматически исключены из анализа во время сканирования. Отображается постоянно обновляемая карта сохранения (keep map). Как данные, так и изображения доступны во время запуска для визуального осмотра.

Числовые данные и обработанные изображения сохраняются автоматически. После анализа всех изображений данные можно экспортировать в стороннее программное обеспечение, такое как Excel, GraphPad или Prism. На данном рисунке представлены архивные изображения сканирования образцов, обработанных контрольным раствором и BCI, с проведением и без проведения анализа CNT.

Примененный зеленый флуоресцентный белок или GFP обнаруживается в глазу, на границе среднего и заднего мозга, а также в тройничных ганглиях трансгенных эмбрионов. Обратите внимание, что и интенсивность GFP, и области экспрессии расширены. В эмбрионах, обработанных BCI, наблюдается дозозависимый эффект BCI на экспрессию репортерного гена GFP в трансгенных эмбрионах.

Концентрация, необходимая для достижения половины максимального ответа, или EC 50, составила приблизительно 12 micromolar. Мы только что продемонстрировали вам, как разводить, собирать и размещать эмбрионы трансгенных zebrafish по 96-луночным планшетам. Мы добавили возрастающие концентрации PCI в качестве активатора сигнального пути.

Мы также продемонстрировали, как автоматизировать получение изображений трансгенных эмбрионов, и проанализировали эти изображения с помощью специально разработанного алгоритма на основе технологии когнитивных сетей. С помощью этого подхода мы смогли количественно и дифференцированно измерить эффекты действия низкомолекулярного активатора сигналинга фактора роста фибробластов. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательного отбора эмбрионов для минимизации вариабельности между образцами.

На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.