Крупномасштабные данио рерио основе В естественных условиях Малый экран Молекула

Общая цель следующего эксперимента заключается в поиске малых молекул, которые специфически модулируют ключевые аспекты эмбрионального развития и физиологии. Это достигается путем помещения большого количества оплодотворенных икринок в 96-луночные планшеты, которые на втором этапе используются для скрининга. В лунки с эмбрионами добавляют аликвоты из библиотеки малых молекул.

Луночные планшеты исследуют на наличие фенотипов, вызванных малыми молекулами. Полученные результаты позволяют определить, какие малые молекулы специфически влияют на развитие или физиологию супер-рыбок. Здравствуйте, меня зовут Чарльз Хонг, я представляю медицинский факультет Университета Вандербильта.

В нашей лаборатории мы проводим высокопроизводительный химический скрининг с использованием эмбрионов данио-рерио. Это относительно простой метод, который может быть широко адаптирован для поиска новых биоактивных соединений. Днем накануне дня химического скрининга подготовьте от 10 до 20 резервуаров для разведения данио-рерио.

Установите перегородку в каждый аквариум и наполните их водой из системы аквакультуры; с помощью сачка перенесите одного взрослого самца и одну или двух взрослых самок во внутренний контейнер. В день проведения опыта утром промаркируйте каждый репродукционный аквариум и накройте их крышками. Извлеките перегородки из репродукционных аквариумов, чтобы дать данио-рерио возможность спариться.

В течение следующего часа дайте оплодотворенным икринкам провалиться сквозь сетку в нижней части каждого внутреннего контейнера. Через один час верните взрослых особей рыбы зебра обратно в танки для постоянного содержания.

Извлеките внутренний контейнер и соберите икру, процедив воду из каждого нерестового аквариума через пластическое ситечко для чая. Переверните ситечко над чашкой Петри и осторожно промойте его, чтобы икринки попали в чашку. С помощью промывочной бутылки с питательной средой E three удалите все неоплодотворенные икринки, которые выглядят непрозрачными.

С помощью одноразовой пластиковой пипетки из каждого скрещивания должно получиться примерно 200 эмбрионов. Затем с помощью стеклянной пастеровской пипетки перенесите примерно пять эмбрионов в среде E3 в каждую лунку 96-луночного планшета. После этого эмбрионы будут распределены по 96-луночному планшету.

Максимально удалите среду E3 из лунок с помощью 12-канального дозатора, стараясь не повредить эмбрионы. Затем с помощью 12-канального дозатора внесите 250 µL среды E3.

Как можно быстрее добавьте в каждую лунку среду, содержащую 0,5 µg/mL канамицина, чтобы эмбрионы не пересохли. Поместите 96-луночные планшеты в инкубатор при температуре 28,5 °C до достижения стадии, на которой необходимо добавить соединения. В данном протоколе мы ищем соединения, нарушающие раннее формирование паттернов эмбриона, и будем инкубировать эмбрионы в течение трех часов или до тех пор, пока более 90% эмбрионов не достигнут стадии 1000 клеток, на которой обычно поставляются библиотеки малых молекул.

В исходном 96-луночном планшете, где каждое соединение хранится в DMSO в виде 10 мМ стокового раствора, примерно за 60 минут до достижения эмбрионами нужной стадии разморозьте соответствующее количество 96-луночных планшетов с аликвотами малых молекул. Запишите серийный или иной идентификационный номер исходных планшетов. Для минимизации конденсации на планшетах поместите их в камеру высушивания с осушителем. Справа.

Кратковременно центрифугируйте планшеты в настольной центрифуге, оснащенной адаптером для многолуночных планшетов. Удалите алюминиевую фольгу с планшета-источника; с помощью 12-канального дозатора разведите соединения в планшете-источнике до требуемой концентрации с помощью DMSO. В данном протоколе используется конечная концентрация 0.5 millimolar, для чего к стоковому раствору с концентрацией 10 millimolar в планшете добавляют 4.75 microliters DMSO.

Когда эмбрионы в 96-луночном планшете достигнут нужной стадии, с помощью 12-канального дозатора перенесите 2,5 µL соединений из исходных планшетов в планшеты-реципиенты с эмбрионами. Закройте крышками планшеты, содержащие эмбрионы и соединения, и запишите идентификационный номер исходных планшетов на планшетах с эмбрионами. Перемешайте содержимое планшетов путем осторожного кругового встряхивания и поместите их в инкубатор при температуре 28,5 °C.

Накройте каждую исходную планшетку с неиспользованными малыми молекулами алюминиевой фольгой, закрепите лентой и поместите в морозильную камеру при температуре -80 °C для длительного хранения. Перед проведением визуального скрининга сформулируйте конкретный критерий хита. Например, при скрининге малых молекул — ингибиторов развития переднего мозга хитом может считаться соединение, вызывающее потерю переднего мозга.

Отсутствие глаз является простым визуальным индикатором потери переднего мозга и не требует использования флуоресценции для анализа на нужных этапах развития. Извлеките из инкубатора 96-луночные планшеты с эмбрионами, подвергшимися воздействию соединений, и осмотрите каждую лунку под стереомикроскопом. При скрининге низкомолекулярных ингибиторов развития переднего мозга осматривайте планшеты через 28 часов на предмет отсутствия глаз как маркера подавления развития переднего мозга. Запишите номер планшета и номер лунки для каждого случая, когда как минимум три из пяти эмбрионов проявляют указанный фенотип. Поместите 96-луночный планшет обратно в инкубатор.

Повторно подтвердите отсутствие глаз и переднего мозга через 48 часов. Несмотря на отсутствие переднего мозга, эмбрионы будут жизнеспособны как минимум в течение четырех дней. Подтвердите потенциальный результат, повторно протестировав воздействие соединения в нескольких дозах; для каждой дозы тестируют 10 эмбрионов в 0,5 milliliters среды E3 в 48-луночном планшете.

Время подготовки соединений для повторного тестирования должно быть идентичным времени, использованному при первоначальном скрининге. HIIT считается подтвержденным, если при повторном тестировании соединения вызванный фенотип воспроизводится дозозависимым образом. В завершение определите соединение-хит по базе данных малых молекул в химической библиотеке.

Используя визуальный химический скрининг на модельных рыб-зебрафиш, мы обнаружили низкомолекулярный ингибитор сигнального пути hedgehog, основываясь на его воздействии на ось тела. На данном изображении представлены эмбрионы, подвергшиеся воздействию ингибитора hedgehog, у которых наблюдается выраженный вентральный изгиб хвоста. Эмбрионы, обследованные через 24 часа, при повторном анализе через 48 часов по-прежнему демонстрируют фенотип с вентральным изгибом.

На этом изображении представлен эмбрион, обработанный соединением, в сравнении с эмбрионом с мутацией пути hedgehog. После освоения данной методики один человек может проводить скрининг примерно 400 соединений в неделю, затратив на это всего несколько часов. Данный метод также открыл химикам-биологам возможности для изучения таких процессов, как развитие клеток, клеточные сигнальные пути и эмбриональное развитие.

При работе с нехарактеризованными малыми молекулами важно соблюдать технику безопасности и использовать лабораторные халаты и перчатки, так как такие нехарактеризованные молекулы могут быть потенциально опасны.