Live-камера и цифровой обработки изображений Количественный анализ эмбриональных эпителиальных клеток в Xenopus laevis
23 мая 2010 г.
Xenopus эмбрионального эпителия являются идеальной системой модель для изучения ячейки поведения, таких как развитие полярности и изменением формы во время эпителиальных морфогенеза. Традиционные гистологии основных образцов все чаще дополняется жить-клеточной конфокальной микроскопии. Здесь мы показываем, методы, чтобы изолировать лягушки тканей и визуализировать жить эпителиальных клеток и их цитоскелета с использованием живых-клеточной конфокальной микроскопии.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать методы визуализации живых объектов и простые способы количественного анализа для изучения морфологии эпителиальных клеток эмбриона. Для этого сначала необходимо подготовить все инструменты и оборудование. Вторым этапом процедуры является выделение эксплантатов X из эмбрионов лягушки и их размещение в камерах для длительного культивирования.
Третьим этапом процедуры является получение изображений эпителиальных клеток в высоком разрешении в режиме реального времени. Заключительным этапом процедуры является количественный анализ морфологических особенностей эпителиальных клеток с помощью Image J. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие отслеживаемые области клеток и интенсивность мембран с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения. Здравствуйте, я Сагар Джоши из лаборатории Дэвидсона кафедры биоинженерии Питтсбургского университета.
Сегодня мы продемонстрируем процедуру визуализации живых клеток и количественного анализа эмбриональных эпителиальных клеток Xenos lavia. Мы используем этот метод для изучения изменений цитоскелета клеток в режиме реального времени. Итак, приступим.
Для подготовки камер для культивирования анимальных полюсов эмбрионов используйте силиконовую смазку для герметизации специальной акриловой камеры или небольшой нейлоновой шайбы к большому покровному стеклу размером 45 by 50 мм. Добавьте в камеру 1 mL 1% BSA в одной трети XMBS. Покройте небольшие фрагменты покровных стекол тем же раствором и инкубируйте от двух до четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
Чтобы уменьшить адгезию эксплантата X к стеклу, промойте камеру и заполните ее средой DFA. Непосредственно перед переносом эксплантатов X промойте фрагменты покровного стекла таким же образом. Затем погрузите их в чашку с эмбрионами в культуре DFA, в которые на стадии от 1 до 4 клеток была проведена микроинъекция соответствующей мРНК, до достижения нужной стадии в 1/3 XMBS. Используйте переносящую пипетку со скошенным отверстием для переноса эмбрионов в чашку с DFA под разрезным стереомикроскопом.
С помощью пинцета извлеките эмбрионы для иссечения животного полюса. Используйте волосяную петлю, чтобы зафиксировать эмбрион в одном положении. С помощью волосяного ножа сделайте небольшой разрез в области животного полюса.
Выполните серию повторяющихся плавных режущих движений, чтобы расширить разрез и удалить эктодерму колпачка. Аналогичным образом вырежьте три или четыре экспланта. С помощью переносящей пипетки переместите их в подготовленную культуральную камеру.
Используя петлю из волоса, расположите каждый эксплантат X таким образом, чтобы эпителий был обращен к дну камеры. С помощью пинцета удерживайте фрагмент покровного стекла за центр.
Смажьте концы силиконовой смазкой. Поместите по одному фрагменту над каждым X explan. Слегка зафиксируйте каждый фрагмент на месте, нанеся небольшое количество силиконовой смазки.
Осторожно, не прилагая избыточной силы, чтобы не раздавить X explan полностью. Заполните камеру DFA и смажьте верхние края камеры силиконовой смазкой. Затем закройте верхнюю часть покровным стеклом размером 24 x 40 миллиметров.
Отрегулируйте уровень DFA в камере, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха, и с помощью салфетки удалите излишки жидкости. Теперь растения X могут находиться на длительном культивировании в герметичной камере в течение одного дня при комнатной температуре; установите 20-кратный объектив конфокального микроскопа. Поместите камеру с эксплантом X на предметный столик микроскопа и положите на камеру небольшие балансировочные грузы, чтобы зафиксировать ее положение при освещении в светлом поле.
Отрегулируйте фокус и используйте перемещение по оси Z, чтобы визуализировать апикальные концы поверхностных клеток. Переключитесь на флуоресцентный режим и объектив с большим увеличением. Для получения одиночных снимков или таймлапс-видео эксплантированного эпителия настройте параметры сбора данных для достижения максимально возможного качества изображения.
Для получения рекомендаций по настройке и визуализации обратитесь к текстовой части данного протокола. Поддерживайте мощность лазера на минимально возможном уровне. Получите статические изображения или таймлапс-видео эпителия x explan.
Рекомендации по сбору данных приведены в текстовой части протокола. Данные из файлов конфокальных изображений могут быть извлечены различными способами. Ниже приведены два примера анализа файлов данных с помощью программного обеспечения Image J с плагином Bio-Formats.
Для измерения площади эпителиальной клетки откройте меню Analyze и выберите Set Measurements. С помощью инструмента выделения на панели инструментов обведите клетку; затем в меню Analyze выберите Tools, а далее — ROI Manager. Чтобы открыть менеджер областей интереса, нажмите Control T.
Чтобы добавить контуры в менеджер ROI, выберите и добавьте столько контуров с изображения, сколько необходимо. Затем нажмите кнопку save, чтобы сохранить набор ROI в менеджере ROI. Нажмите measure.
В окне результатов теперь будут отображаться измеренные площади каждого ROI. Чтобы измерить интенсивность клеточной мембраны, выберите инструмент «прямая линия» (straight line) на панели инструментов ImageJ. Проведите линию перпендикулярно мембране.
Нажмите CTRL T, как в предыдущем примере. Чтобы добавить выделенную область в менеджер ROI, откройте меню Analyze и выберите Plot Profile, чтобы построить график относительной интенсивности вдоль линии. Чтобы сохранить график в виде изображения, нажмите Save в появившемся окне построения графика.
Откройте выпадающее меню «Файл», затем выберите «Сохранить как». Мы только что продемонстрировали вам способ получения прижизненных изображений и количественного анализа эмбриональных эпителиальных клеток из эксплантатов CapEx удаленного органа животного. При выполнении этой процедуры важно не забыть добавить антибиотик и антимикотик в DFA. Чтобы предотвратить рост бактерий и грибков, соблюдайте особую осторожность при прижимании эксплантатов покровными стеклами, так как избыточное давление может привести к раздавливанию эксплантата.
Также важно помнить о необходимости использования оптимальных настроек конфокального микроскопа для получения данных с максимально высоким качеством изображения. На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлены методы прижизненной визуализации для изучения морфологии эпителиальных клеток эмбриона Xenopus. Особое внимание уделяется методам выделения тканей лягушки и визуализации живых эпителиальных клеток с помощью конфокальной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология развития
Теоретическая часть
- Эмбриональный эпителий Xenopus служит моделью для изучения поведения клеток.
- Визуализация живых клеток дополняет традиционную гистологию.
- Понимание морфогенеза эпителия имеет решающее значение для исследований развития.
- Конфокальная микроскопия позволяет визуализировать клеточную динамику в режиме реального времени.
Цель исследования
- Продемонстрировать методы визуализации живых эпителиальных клеток.
- Количественно оценить морфологические характеристики эпителиальных клеток.
- Представить протокол выделения и культивирования тканей лягушки.
Используемые методы
- Подготовка инструментов и аппаратуры для визуализации.
- Выделение тканей из эмбрионов лягушки для культивирования.
- Получение изображений эпителиальных клеток с высоким разрешением.
- Количественный анализ морфологии клеток с помощью программного обеспечения Image J.
Основные результаты
- Были получены изображения живых эпителиальных клеток с высоким разрешением.
- Количественный анализ позволил определить площади отслеживаемых клеток и интенсивность мембранного окрашивания.
- Визуализация живых клеток позволила получить сведения о поведении клеток в процессе морфогенеза.
- Методы были валидированы для длительного культивирования тканей лягушки.
Выводы
- Конфокальная микроскопия живых клеток эффективна для изучения эпителиальных клеток.
- Данные методы могут быть применены в различных исследованиях по биологии развития.
- Результаты расширяют понимание морфогенеза эпителия.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация живых клеток и количественный анализ эмбриональных эпителиальных клеток Xenopus laevis представляют собой динамическую платформу для изучения морфогенетических процессов, имеющих значение для раннего поиска и валидации мишеней. Конфокальная микроскопия высокого разрешения позволяет в режиме реального времени измерять морфологию клеток и локализацию белков, что повышает прогностическую достоверность моделей в биологии развития. Данный рабочий процесс увеличивает трансляционную значимость эпителиальных систем для механистического снижения рисков и приоритизации портфеля препаратов в доклинических исследованиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет в режиме реального времени напрямую наблюдать за изменениями цитоскелета и динамикой формы клеток.
- Обеспечивает функциональную валидацию молекулярных мишеней, участвующих в морфогенезе эпителия.
- Способствует снижению неопределенности механизмов путем количественной оценки площади клеток и изменений интенсивности мембранного окрашивания.
- Предоставляет платформу для проверки гипотез относительно путей развития.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем с живыми клетками для последующего количественного имиджинга.
- Стандартизация измерения морфологических параметров с помощью воспроизводимого анализа в Image J.
- Обеспечение возможности высокопроизводительного скрининга соединений, влияющих на поведение эпителиальных клеток.
- Поддержка масштабируемости анализа и повторного использования платформы для сравнительных исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям, релевантным для заболеваний, за счет регистрации динамических эпителиальных процессов.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации благодаря количественным результатам.
- Снижает биологические риски, обеспечивая прогностический мониторинг состояния клеток в режиме реального времени.
- Способствует идентификации биомаркеров посредством прижизненной визуализации локализации белков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод интегрируется в континуум открытий — от раннего тестирования гипотез до валидации доклинических моделей, используя визуализацию живых клеток для получения надежных данных.
- Поисковая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей посредством морфологического анализа в реальном времени.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет точные измерения площади клеток и интенсивности мембраны для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает поисковые и доклинические исследования, поддерживая моделирование систем, имеющих значение для патологии заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для визуализации и анализа для различных исследований эпителия.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неопределенность в биологии эпителия.
- Операционная ценность: Способствует стандартизации, воспроизводимости и масштабируемости рабочих процессов при визуализации живых клеток.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработок и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления надежных количественных данных.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение активов на этапе открытия.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией и количественным анализом изображений.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для визуализации и программному обеспечению для анализа (например, Image J).
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов визуализации и измерений.
- Может потребоваться адаптация для различных модельных систем или типов тканей.
- Качество данных зависит от оптимальных условий культивирования и осторожного обращения с образцами.
