Изучение воздействия Матрица жесткости на клеточную функцию использования на основе акриламида Гидрогели

Для моделирования податливости тканей in vivo с использованием акриламидных гидрогелей сначала подготавливают реактивные нижние покровные стекла и силиконизированные верхние покровные стекла. Вторым этапом процедуры является заливка и создание акриламидных гидрогелей.

Третьим этапом процедуры является сшивка выбранного белка внеклеточного матрикса с гидрогелем. Заключительным этапом процедуры являются инкубация и анализ клеток. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие, как изменение податливости внеклеточного матрикса in vitro регулирует поведение клеток, путем анализа с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии, количественной ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру синтеза и использования акриламидных гидрогелей. В нашей лаборатории этот метод применяется для изучения влияния жесткости внеклеточного матрикса на морфологию клеток, клеточную сигнализацию и пролиферацию. Приступим к работе.

Начните выполнение данной процедуры с подготовки реакционноспособных покровных стекол. Сначала нанесите слой парафильма на нижнюю половину чашки Петри диаметром 150 мм. Затем перенесите до девяти автоклавированных покровных стекол диаметром 25 мм на парафильм и залейте их 1 мл 0,1 M гидроксида натрия.

Инкубируйте покровные стекла в течение трех минут. После инкубации удалите гидроксид натрия с помощью вакуумной линии, работая в вытяжном шкафу. Пипетируйте по 0.5 milliliters три(аминопропил)триметоксисилана (APTMS) на каждое покровное стекло. Инкубируйте покровные стекла в течение трех минут, затем удалите APTMS. Соблюдайте осторожность и не допускайте слишком длительной инкубации, чтобы избежать образования пены на стекле.

Предметные стекла после обработки. Промойте покровные стекла один раз 20 миллилитрами деионизированной воды в той же чашке. Извлеките покровные стекла из чашки с помощью изогнутого пинцета и перенесите их обработанной стороной вверх в новую чашку диаметром 150 миллиметров.

Затем снова промойте покровные стекла деионизированной водой и поместите их на шейкер на 10 минут. После инкубации слейте воду и промойте стекла еще два раза. Очень важно полностью удалить APTMS, чтобы он не вступил в реакцию с глутаровым альдегидом и не образовал мутный белый осадок за 10 минут до использования глутарового альдегида.

Используя изогнутый пинцет, перенесите покровные стекла в чистую чашку со слоем парама и удалите остатки жидкости с помощью вакуумной линии, затем полностью покройте каждое покровное стекло 0,5 миллилитрами 0,5% глутаральдегида в стерильной деионизированной воде для сшивания APTMS и полиакриламидного геля. Инкубируйте покровные стекла в течение 30 минут в вытяжном шкафу. Затем удалите глутаральдегид и повторно промойте покровные стекла деионизированной водой.

Затем полностью высушите покровные стекла. Перенесите новые покровные стекла в пробирку Falcon объемом 50 мл, содержащую 10% раствор surface seal в хлороформе, и перемешивайте путем покачивания в течение не менее 10 минут. Слейте раствор surface seal и высушите стекла на воздухе.

Положите покровные стекла на салфетки Kim wipes в боксе биологической безопасности, где будут готовиться гидрогели, чтобы начать подготовку гидрогелей. Используя изогнутый пинцет, перенесите покровные стекла реактивной стороной вверх на лист парафильма, закрепленный скотчем на поверхности бокса биологической безопасности. Убедитесь, что покровные стекла лежат плоско на поверхности парафильма.

Затем приготовьте насыщенный раствор NHS (N-гидроксисукцинимида) в толуоле, растворив небольшое количество NHS в достаточном объеме толуола. Для конкретных экспериментов добавляйте NHS небольшими порциями до тех пор, пока он не перестанет растворяться. Насыщенный раствор обычно имеет мутный розовый цвет.

Затем приготовьте смесь акриламида, БИС-акриламида, воды и ПС для достижения требуемого процента акриламида. Добавьте реагенты в микроцентрифужные пробирки согласно письменному протоколу. Затем добавляйте по одной аликвоте за раз.

Добавьте NHS и TM me. Кратковременно перемешайте содержимое пробирки на вортексе и немедленно распределите раствор между тремя-пятью гелями, используя по 140 µL на каждое покровное стекло, работая в шкафу биологической безопасности. Быстро поместите силиконизированное покровное стекло диаметром 25 мм поверх каждого геля до начала его полимеризации.

Накрытие верхним покровным стеклом позволит акриламиду полностью покрыть нижнее покровное стекло. Инкубируйте полученный «сэндвич» при комнатной температуре до момента полимеризации акриламида. Чтобы определить, завершилась ли полимеризация, проверьте остаток раствора акриламида в микроцентрифужной пробирке.

Полимеризация займет несколько минут для жестких гелей и чуть больше времени для мягких гелей. После завершения полимеризации осторожно поднимите «сэндвич», используя стерильные перчатки. Затем сдвиньте верхнее покровное стекло до тех пор, пока оно не будет выступать за край полимеризованного геля.

Затем подденьте крышку. Снимите гель и выбросьте верхнее покровное стекло. Поместите каждое нижнее покровное стекло геля, далее называемое гидрогелем, в планшет на шесть лунок.

Затем добавьте по 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в каждую лунку шестилуночного планшета. После этого промойте гидрогели буфером PBS и инкубируйте на шейкере в течение пяти минут. Повторите промывку дважды.

Для начала эксперимента покройте каждый гидрогель двумя миллилитрами раствора фибронектина или другого белка внеклеточного матрикса. Инкубируйте белок на гидрогеле в течение ночи при температуре 4 °C для обеспечения его ковалентного связывания с гидрогелем; по окончании ночной инкубации аспирируйте раствор ВКМ. Затем заблокируйте нереактивные группы NHS, используя раствор безжировой бычьей сывороточной альбумина, активированной нагреванием, в концентрации 1 мг/мл в безсывороточной среде, и инкубируйте в течение не менее 30 минут при 37 °C.

После инкубации однократно промойте гидрогели стерильным PBS. Затем высейте клетки в соответствующую культуральную среду с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки. Высевайте клетки непосредственно на гидрогель.

Используют установленную линию эмбриональных фибробластов мыши. Определяют количество клеток для высева на гидрогель, исходя из требуемой степени распластывания клеток и конфлюэнтности для проведения эксперимента. Для проведения вестерн-блоттинга и количественной ПЦР требуется примерно 10⁵ клеток.

Затем инкубируйте клетки в условиях, соответствующих конкретному типу клеток. По окончании периода инкубации выделите белок или мРНК клеток в зависимости от целей исследования.

Нанесите пипеткой капли лизирующего буфера объемом 100 µL на лист параформы на лабораторном столе, оставляя примерно два-три сантиметра между каплями. Затем осторожно извлеките каждый гидрогель, приподняв нижнее покровное стекло из лунки. С помощью изогнутого пинцета поместите гидрогель стороной с клетками вниз на капли.

Инкубируйте клетки в лизирующем буфере ровно одну минуту. Затем снимите покровные стекла и перенесите лизирующий буфер в микроцентрифужную пробирку. В качестве альтернативы, при экстракции РНК, перенесите каждый гидрогель в новый 6-луночный планшет и добавьте по 1 мл триазола в каждую лунку.

После инкубации выдержите гели в течение трех минут. Удалите раствор триазола для хранения в микроцентрифужной пробирке. Тщательная промывка покровных стекол после добавления A-P-T-M-S является важным этапом получения реакционноспособных покровных стекол.

На надлежащим образом промытых и высушенных покровных стеклах отсутствуют какие-либо остатки осадка. A-P-T-M-S будет вступать в реакцию с глутаровым альдегидом с образованием белого мутного осадка. При появлении осадка всю процедуру необходимо повторить, так как покровное стекло становится непригодным для использования.

После формирования гидрогеля и его покрытия белками ВКМ проводят посев клеток на ночь. Наблюдается заметная разница в распластывании клеток на жестких и мягких гидрогелях, что видно по окрашиванию фойдином: клетки эмбриональных фибробластов мыши распластываются в большей степени на жестких гидрогелях по сравнению с мягкими. В действительности большинство клеток, прикрепляющихся к мягкому гидрогелю, остаются компактными и прикрепляются менее эффективно.

Репрезентативные результаты количественной ПЦР уровней мРНК cycling D1 в эмбриональных фибробластах мыши показывают, что экспрессия cycling D1 значительно повышается на жестком матриксе, но не на мягком. Это говорит о том, что жесткость матрикса регулирует прогрессию клеточного цикла in vitro. Мы только что продемонстрировали вам способ создания гидрогелей с различной жесткостью для моделирования физиологических условий in vivo. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости изготовления дополнительных реактивных покровных стекол, так как возможны ошибки или случайная порча образцов.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.