Оценка Иммунологически Соответствующие Динамическая третичный Структурные особенности ВИЧ-1 петли V3 Последовательность R2 короны на Неэмпирических Складные

Общая цель следующего эксперимента заключается в оценке динамических структурных предпочтений последовательности V3-петли пептида штамма R2 ВИЧ с помощью фолдинга AR и сопоставлении полученных результатов с известной чувствительностью штамма R2 к нейтрализации. Это достигается путем выбора подходящего фрагмента V3-петли штамма R2 для AR-фолдинга. На втором этапе проводится симуляция фолдинга, в ходе которой перебираются все возможные конформации фрагмента петли R2 и наиболее вероятные конформации записываются в стек-файл.

Затем проанализированные зафиксированные конформации используются для определения динамического структурного предпочтения коронки R2V3, которое могло бы объяснить ее чувствительность к нейтрализации. Полученные результаты указывают на предпочтение жестких позиций бета-тяжа с 12 по 14 в петле V3, основываясь на вторичной структуре, предпочтениях и распределении энергии стека исследованных конформаций. Здравствуйте, я Тимоти Кардозо, обращаюсь к вам из своей лаборатории на кафедре фармакологии медицинского факультета Нью-Йоркского университета.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру фолдинга белка in vitro для гибкой петли иммуногенного вирусного белка ВИЧ-1, известного как GP120. Гибкая петля представляет собой петлю V3 этого поверхностного белка-гликопротеина оболочки вируса ВИЧ-1, а её кончик называют вершиной петли V3. Именно этот участок мы будем подвергать фолдингу.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории, чтобы определить перспективные пути разработки эффективных вакцин против ВИЧ. Итак, приступим. Для начала процедуры выберите последовательность V3 crown, которую необходимо подвергнуть фолдингу in silico.

Предыдущие исследования нашей лаборатории показывают, что позиции с 10 по 22 любой последовательности петли V3 дают наилучшие результаты; проведите эксперименты по фолдингу armenio, используя удобные выпадающие меню в графическом пользовательском интерфейсе (GUI) программного обеспечения для молекулярного моделирования ICM Pro. Сначала в виртуальном пространстве компьютера должна быть построена трехмерная атомная структура пептида, соответствующего этой последовательности. Чтобы построить трехмерную атомную структуру, перейдите в меню «File» (Файл) и выберите «New» (Новый).

После этого откроется экран с несколькими вкладками. Выберите вкладку peptide и вставьте или введите последовательность в текстовое поле. Нажмите okay, чтобы построить трехмерную структуру пептида.

Структура отобразится в графическом окне ICM. После построения трехмерной структуры перейдите в меню молекулярной механики (molecular mechanics) и выберите пункт «минимизировать» (minimize), который откроет боковое меню. В этом меню выберите «глобальная» (global).

На экране появятся несколько полей ввода и флажков, в которых по умолчанию уже выбраны стандартные параметры. При необходимости измените настройки, чтобы выбрать пептид для фолдинга. Отрегулируйте длительность и точность симуляции, изменив соответственно количество глобальных перемещений (global moves) и количество вызовов локального минимума (local min calls).

Выберите «all» для фолдинга всех атомов пептида. Затем выберите «save movie», чтобы создать видеофайл процесса фолдинга. В завершение нажмите «apply», чтобы запустить фолдинг в графическом окне.

Алгоритм начинает сворачивание пептида в различные конформации, вычисляя и записывая энергию пептида для каждой из них. По завершении процесса наиболее энергетически стабильная конформация пептида, а также альтернативные конформации с близким значением энергии будут определены и визуализированы на компьютере при выполнении фолдинга пептида. Использование графического интерфейса позволяет продемонстрировать процесс сворачивания, но не обеспечивает идеальный подбор параметров для фолдинга петли V3 crown.

Для этой цели лучше всего выполнять фолдинг из неграфического интерфейса командной строки с помощью скрипта. Скрипт представляет собой последовательность текстовых команд, сохраненных построчно в документе или текстовом файле, которые автоматически подаются в программу ICM и исполняются одна за другой для фолдинга петли V3. Сначала создайте текстовый файл и сохраните его в локальном каталоге на жестком диске компьютера. Как и прежде, начните с построения пептида в виртуальном пространстве компьютера.

Затем присвойте имя симуляции и установите количество свободных переменных, которыми являются химические связи в пептиде, остающиеся свободными для вращения при фолдинге. Далее укажите продолжительность симуляции, необходимую для оптимального фолдинга петли V3. Это значение будет зависеть от количества свободных переменных, определенных на предыдущем этапе; чтобы установить точность конформационного поиска в эксперименте, задайте количество шагов поиска, которые должны быть выполнены в каждом локальном минимуме.

Затем установите остальные параметры, оптимизированные для симуляции на основе предыдущих исследований, включая минимизацию температуры, градиент и распределение вероятностей. После настройки экспериментальных параметров укажите, какие расчеты энергии будут использоваться во время фолдинга. В данном случае энергия Ван-дер-Ваальса обозначается как VW internal peptide.

Энергия обозначается как 14, энергия водородных связей — как HB, электростатическая энергия — как El, энергия сольватации обозначается как SF, а энтропия — как EN. Укажите окончательные параметры, включая предпочтительные углы основной цепи и боковых цепей для поиска, а также исходную конформацию.

Наконец, напишите команду для запуска и сохранения расчета. После того как скрипт будет написан и сохранен в виде текстового файла, запустите его из командной строки операционной системы компьютера. Как и прежде, наиболее энергетически стабильная конформация пептида, а также альтернативные конформации с сопоставимой энергией будут определены и сохранены в файле проекта для последующей визуализации на компьютере.

После завершения расчета откройте файл, выбрав пункт «file open» в выпадающем меню EE. Отобразите молекулу, отметив галочкой соответствующий флажок на панели рабочего пространства, и выберите режим «molecular mechanics stack view». Чтобы просмотреть стопку наиболее энергетически выгодных конформаций пептида, полученных в результате фолдинга, нажмите на инструмент построения графиков в правом нижнем углу панели стопки для визуализации результатов.

Сначала нажмите «ОК» в появившемся окне, затем перейдите на среднюю вкладку графика под названием «best confo». После этого выберите первую строку в таблице результатов, которая соответствует конформации с наименьшей энергией, обнаруженной в ходе поиска. Структура пептида в графическом окне перестроится в конформацию с минимальной энергией.

Проанализируйте данную конформацию на наличие характеристик, подобных бета-слою или альфа-спирали, особенно в первых пяти позициях пептида. Для этого выберите данный регион в последовательности и нажмите на иконку в виде палочек в верхнем левом углу экрана, чтобы отобразить все атомы. Затем необходимо проанализировать набор результатов энергии для построения графиков наилучших конформаций.

Если конформация с наименьшей энергией отделена значительным разрывом от остальных конформаций, это указывает на тенденцию к формированию жесткой структуры. Чтобы оценить результаты, откройте флакон проекта и выберите режим просмотра стека молекулярной механики (molecular mechanics stack view); появится таблица конформаций стека. Визуализируйте конформации стека, нажав на иконку гистограммы.

Наконец, нажмите molecular mechanics stack play, чтобы создать анимацию стека и визуализировать конформационные предпочтения, выявленные в процессе фолдинга. Представлены результаты фолдинга R two. Конформация не является альфа-спиральной и представляет собой статистический клубок, что ожидаемо для V three loop crowns, особенно в фрагменте с 12 по 14 остаток.

В петле V3 на протяжении всего стека наблюдается выраженное конформационное предпочтение бета-слоя, в то время как альфа-спиральные конформации встречаются крайне редко. Локальная конформация бета-слоя распознается по её вытянутой линейной форме. Именно здесь находится необычная последовательность изолейцин-пролин-метионин штамма R2, которая редко встречается в штаммах ВИЧ в данной позиции и, согласно гипотезе, может быть ответственна за необычные особенности R2.

Кроме того, между конформацией с самой низкой энергией и второй по минимальности энергии наблюдается энергетический разрыв почти в три единицы. Таким образом, структура отклоняется от конформации с самой низкой энергией менее чем в 1% случаев, что указывает на то, что корона R two V three и ее локальная бета-напряженная конформация в позициях с 12 по 14 обладают более жесткой структурой, а не являются полностью гибкими по своей природе. Мы только что продемонстрировали вам способ фолдинга последовательности короны петли V three с помощью алгоритма abio, реализованного в программном обеспечении ICM, а также показали, как анализировать результаты, используя штамм R two вируса ВИЧ.

Например, при выполнении данной процедуры важно тщательно подобрать последовательность фолдингового пептида, соответствующую фрагменту V-трехкорончатого домена, а также интерпретировать результаты относительно конформационных предпочтений и энергии, используя экспертные консультации специалиста по молекулярному моделированию. На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.