Transnuclear Мыши с Предустановленные Т Особенности клеточного рецептора Против Toxoplasma гондий, Полученные через SCNT
30 сентября 2010 г.
Мы показываем здесь, что эпигенетические перепрограммирования через пересадки ядра соматической клетки (SCNT) может быть использован как инструмент для создания моделей мышей с заранее определенными рецепторами Т-клеток (TCR) особенностей. Эти transnuclear мышей выразить соответствующее TCR от их национального локуса под контролем эндогенных промоутера.
Трансгенные мыши с антигенспецифичными Т-клеточными рецепторами оказались незаменимыми при изучении развития и функций Т-клеток, что позволило создавать мышиные модели с предопределенной специфичностью Т-клеточных рецепторов с помощью переноса ядер соматических клеток или SCNT. Мышь заражают интересующим патогеном. Т-клетки выделяют из организма мыши, после чего их очищают методом сортинга клеток с флуоресцентной активацией.
Очищенные Т-клетки затем используют для переноса ядер соматических клеток. После достижения эмбрионами стадии бластоцисты изолируют эмбриональные стволовые клетки. Затем эти клетки вводят в бластоцисты, которые затем переносят псевдобеременным мышам.
У полученных щенков наблюдается выраженное увеличение интересующей популяции Т-клеток, что можно подтвердить с помощью анализа PAX. Здравствуйте, меня зовут Окта АК, я постдок в Белом институте биомедицинских исследований. Сегодня я покажу вам, как выполнять инъекции для бласт-ассистированного переноса соматических CLE, а также перенос эмбрионов.
Основное преимущество соматического переноса заключается в возможности быстрого создания мышиных моделей, экспрессирующих Т-клеточный рецептор из эндогенного локуса и, следовательно, под контролем эндогенного промотора. Соматический перенос в жидкой среде может быть использован в качестве инструмента для создания мышиных моделей с предопределенной специфичностью Т-клеточных или В-клеточных рецепторов. Это представляет особый интерес для специалистов, работающих в таких областях, как аутоиммунитет, инфекционные заболевания и онкология.
Для выделения Т-клеток, специфичных к такому патогену, как Toxoplasma gondii, мышей инфицируют путем внутрибрюшинной инъекции; в пике иммунного ответа селезенку извлекают из эвтаназированной мыши, затем выделяют гомогенизированные донорские клетки и инкубируют их с флуоресцентно меченными антителами и соответствующим тетрамером. Наконец, проводят сортировку клеток для получения Т-клеток, специфичных к патогену. Накануне вечером перед процедурой энуклеации ооцитов.
Подготовьте инъекционные иглы Piso диаметром четыре, пять и семь микрометров, используя шприц для их ретроградного заполнения ртутью. На следующий день приступите к протоколу переноса ядер соматических клеток, собрав ооциты, а затем с помощью ротового дозатора перенесите их в капли среды K-S-O-M-A-A в чашку Петри. В крышку чашки Петри.
Подготовьте планшет для проведения переноса ядер соматических клеток (SCNT), поместив в него примерно 10 капель PVP, примерно 10 капель HCZB, содержащего 5 µg/mL cyto B, и примерно 10 капель HCCB, содержащего 2,5 µg/mL cyto B. Данный планшет далее будет именоваться планшетом S-C-N-T-A. Поместите планшет S-C-N-T-A на предметный столик перевернутого комбинированного микроскопа.
Затем поместите иглу для энуклеации диаметром 7 мкм в микроманипулятор и промойте ее, 5–10 раз втягивая в нее раствор PVP для утилизации. Затем перенесите от 10 до 30 ооцитов, заблокированных на метафазе II, из чашки Петри в одну из капель HCCB с содержанием Cyto B 5 мкг/мл на планшете S-C-N-T-A. Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре; во время инкубации выровняйте ооциты горизонтально.
По истечении пяти минут с помощью иглы для энуклеации переместите ооцит перед удерживающей иглой. С помощью микроинжектора создайте вакуум, чтобы зафиксировать ооцит в микропипетке удерживающей иглы.
Затем с помощью иглы для энуклеации поверните ооцит до тех пор, пока комплекс веретена деления хромосом, который выглядит более прозрачным по сравнению с цитоплазмой, не окажется в положении «на три часа»; нажмите на педаль для подачи пьезо-импульса, чтобы проникнуть через блестяную оболочку зоны пеллюциды. Пьезо-импульс представляет собой механический импульс, который распространяется продольно и вызывает вибрацию кончика иглы для энуклеации. Вибрации кончика облегчают процесс прокола блестящей оболочки зоны пеллюциды.
После прохождения через zona pellucida поместите отверстие иглы для нуклеации рядом с веретеном деления метафазы II и создайте вакуум. Комплекс хромосом и веретена деления медленно переместится в иглу. После извлечения иглы мембрана должна затянуться самостоятельно.
Наконец, с помощью ротовой пипетки перенесите энуклеированные циты обратно в капли K-S-O-M-A-A. Затем, используя ту же пипетку, промойте их, перенося из одной капли KSOM AA в другую. Для проведения переноса ядра замените иглу для энуклеации диаметром 7 мкм на микроманипуляторе на иглу для переноса ядра диаметром 4–5 мкм. Промойте иглу с помощью PVP, как и ранее.
Поместите восемь положительных T-клеток CD, выделенных ранее, в каплю PVP на пластине S-C-N-D-A. Тщательно перемешайте и инкубируйте в течение не менее 10 минут при комнатной температуре. Затем перенесите от 10 до 30 ЭНУКЛЕИРОВАННЫХ цитов в каплю HCZB в концентрации 2.5 µg/mL.
Инкубируйте плашку с Cyto B на S ct. в течение пяти минут при комнатной температуре. Во время инкубации с помощью иглы для переноса ядер выровняйте циты по горизонтали, используя инъекционную иглу.
Подберите донорскую CD8-положительную клетку из среды PVP и несколько раз втяните и вытолкните ее, пока внешняя мембрана не разрушится. При необходимости примените пьезоимпульс; должны стать видны фрагменты мембраны и цитозоля. Втяните ядро в иглу.
Затем продолжайте собирать ядра, пока их количество не достигнет 10–30. Далее перейдите к капле с выровненными энуклеированными цитами. Включите вакуум, чтобы зафиксировать один ооцит на удерживающей игле.
Затем поместите иглу для переноса ядер NU рядом с zop lucita так, чтобы ядра были ориентированы в сторону от отверстия. Подавайте пьезоимпульсы до тех пор, пока игла не пройдет сквозь zop lucita. С помощью микроманипулятора осторожно переместите одно ядро к кончику иглы.
Введите иглу в ооцит так, чтобы ее кончик оказался внутри на две трети длины. Создайте небольшое отрицательное давление, чтобы часть мембраны ооцита затянулась в иглу. Следующий шаг является критически важным.
Так как это единственный момент, когда ооцит фактически открыт, примените один импульс ZO. Затем создайте положительное давление, чтобы вытолкнуть ядро из иглы.
Осторожно вытяните иглу так, чтобы ее кончик находился примерно на одной трети глубины ооцита, затем создайте отрицательное давление и продолжайте вытягивать иглу, чтобы запечатать ооцит. Повторите этот шаг для каждого ооцита.
После того как все ооциты получат ядро, перенесите их в чашку Петри и промойте, перемещая их из одной капли среды KS OM AA, инкубированной при 37 °C в течение не менее 30 минут, в другую. После инкубации перенесите эмбрионы SCNT в капли безкальциевой среды для активации, содержащей хлорид стронция. Хлорид стронция активирует ооцит, индуцируя осцилляции кальция, которые аналогично происходят при оплодотворении.
Инкубируйте в течение шести часов. При необходимости добавьте в среду для активации TSA, который является неспецифическим ингибитором гистондеацетилаз. Чтобы повысить эффективность после активации, осмотрите эмбрионы под инвертированным микроскопом для определения количества псевдопронуклеусов или PPN-положительных эмбрионов SCNT. PPN можно идентифицировать по их внешнему виду.
Они похожи на яйца. Промойте их способом «глазунья» и поместите в культуру. Эмбрионы содержат в каплях K-S-O-M-A-A в течение трех с половиной дней при 37 °C до достижения стадии бластоцисты.
Сначала следует сосредоточиться на правильном выполнении продемонстрированных нами процедур нуклеации и ядерного переноса (NU). После освоения этих методов выполнение последующих процедур станет проще. Использованные эмбриональные стволовые клетки (ES-клетки) были получены с помощью стандартных методов.
Их следует подготовить в день инъекции с помощью бласт-ассистента, через три с половиной дня после коитуса. Подготовьте крышку стерильной чашки для бактерий, нанеся капли, содержащие PVP и HCZP. Затем, как и прежде, подготовьте инъекционную иглу диаметром 15 мкм для импульса pico.
Затем установите инъекционную иглу в микроманипулятор и промойте ее, выполнив от 10 до 30 кратковременных выбросов в каплю HCZB. После этого поместите от 5 до 50 µL суспензии ESL в другую каплю HCZB.
Количество ЭСК должно быть достаточным для того, чтобы их можно было легко захватить, но при этом они не должны быть расположены слишком плотно. Затем с помощью инъекционной иглы захватите от 30 до 100 ЭСК. Переместите их в каплю с бластоцистом.
Выровняйте бластоцисту по горизонтали и зафиксируйте ее с помощью удерживающей иглы, приложив вакуум. Используя инъекционную иглу, поворачивайте бластоцисту до тех пор, пока внутренняя клеточная масса не окажется в положении «девять часов». Установите инъекционную иглу в положении «три часа».
Убедитесь, что на кончике иглы нет ЭК-клеток, и подавайте пикоимпульсы до тех пор, пока инъекционная игла не пройдет сквозь zona lucida и trifecta в бластоцистную полость. Выпустите от 5 до 15 ЭК-клеток так, чтобы они прикрепились к внутренней клеточной массе. Продолжайте процедуру, пока все бластоцисты не будут инъецированы; после завершения инъекций прекратите подачу импульсов.
Промойте дважды в K-S-O-M-A-A и приступайте к хирургическому переносу эмбрионов в псевдобеременные самки; поместите анестезированную мышь-реципиент (псевдобеременную самку) в операционную зону. С помощью электрической бритвы удалите шерсть из нижнего правого квадранта. Продезинфицируйте данную область раствором на основе йода и 70% этанолом под диссекционным микроскопом.
С помощью ножниц рассеките кожу, затем введите закрытые ножницы между кожей и брюшиной и раскройте их, чтобы отделить брюшину от кожи. Найдите через брюшину яичник, который должен выглядеть как красное пятно. После этого с помощью ножниц рассеките брюшину в этой области.
С помощью пинцета осторожно захватите UCT или окружающую жировую ткань и извлеките матку, используя капилляр, подключенный к ротовому пипеточнику. Захватите группу из примерно 10 бластоцист, удерживая яйцевод и матку пинцетом. С помощью иглы сделайте небольшое отверстие в матке.
Затем введите капилляр с бластоцистой в просвет матки и освободите их. Верните матку обратно в брюшную полость. Найдите края брюшины и зашейте ее несколькими стежками.
Закройте разрез на коже мыши несколькими скобами. Подкожно введите обезболивающее средство. Затем перенесите мышь обратно в клетку под греющую лампу.
Следите за дыханием мыши до ее полного пробуждения. После энуклеации и переноса ядер соматических клеток примерно у 70% эмбрионов были обнаружены псевдопронуклеусы.
Как показано на этом рисунке, обработка TSA в течение шести или 10 часов не оказала влияния. Через три с половиной дня культивирования от пяти до 10% эмбрионов развились в бластоцисты.
Опять же, добавление TSA не повлияло на скорость развития бластоцист. Затем полученные путем SCNT бластоцисты были использованы для получения эмбриональных стволовых клеток. TSA значительно повысило эффективность получения ESC из бластоцист.
Клетки S-C-N-T-E-S используются для создания химерных мышей. У этих мышей берут кровь и анализируют ее на наличие специфических T-клеток с помощью проточной цитометрии, как показано здесь. При окрашивании крови антителами к CDA и специфическим тетрамером можно идентифицировать двойную положительную популяцию.
Это указывает на то, что донорская клетка, использованная для SCNT, обладала правильной специфичностью. Я только что продемонстрировал вам, как выполнять перенос LU соматических клеток, инъекции с помощью бластоцист и перенос эмбрионов. Самым важным моментом, который следует учитывать, является чистота ваших T-клеток или B-клеток.
После того как вы освоите методику соматического переноса и ваши эмбрионы достигнут стадии бластоцисты, вы сможете выбрать: перенести их непосредственно псевдобеременным самкам или использовать их для получения эмбриональных стволовых клеток и создания химерных мышей.
Обзор
В данном исследовании демонстрируется использование метода переноса ядер соматических клеток (SCNT) для создания мышиных моделей с предопределенной специфичностью Т-клеточных рецепторов (TCR). Трансгенные мыши экспрессируют TCR из своего эндогенного локуса под контролем эндогенного промотора.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Генетика
Теоретические основы
- Трансгенные мыши имеют решающее значение для изучения развития и функций Т-клеток.
- SCNT позволяет быстро создавать модели мышей.
- Эндогенный контроль экспрессии TCR полезен для исследований.
- Для создания моделей можно выделять Т-клетки, специфичные к определенному патогену.
Цель исследования
- Изучить применимость SCNT для создания мышиных моделей со специфическими TCR.
- Углубить понимание Т-клеточных ответов при различных заболеваниях.
- Предложить методику для быстрого создания моделей.
Используемые методы
- Выделение Т-клеток из инфицированных мышей.
- Флуоресцентная сортировка клеток (FACS) для очистки.
- Протокол SCNT для переноса ядер в ооциты.
- Валидация популяций Т-клеток с помощью PAX-анализа.
Основные результаты
- Успешное получение трансгенных мышей, экспрессирующих специфические TCR.
- Увеличение популяций Т-клеток у полученных потомков.
- Продемонстрированная эффективность SCNT при создании модельных животных.
- Подтвержденная специфичность Т-клеток посредством экспериментального анализа.
Выводы
- SCNT является эффективным методом создания таргетных моделей мышей.
- Такие модели могут быть использованы для изучения аутоиммунитета, инфекционных заболеваний и рака.
- Эндогенная экспрессия TCR повышает релевантность исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Создание мышиных моделей с предопределенной специфичностью Т-клеточных рецепторов с помощью переноса ядер соматических клеток позволяет добиться быстрого эндогенного экспрессии антиген-специфических TCR без использования искусственных промоторов или случайной интеграции. Такой подход снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней, сохраняя физиологическую кинетику и уровни экспрессии TCR. Данный метод повышает точность прогнозов на ранних этапах поиска, предоставляя релевантные для конкретных заболеваний системы для снижения механистических рисков в исследованиях в области иммунологии, инфекционных заболеваний и онкологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, используя Т-клетки с физиологически экспрессируемыми патоген-специфическими TCR из эндогенных локусов.
- Практическая ценность: Обеспечивает быстрый способ создания трансгенных моделей без длительного культивирования или смещения селекции, вызванного воздействием антигена.
- Научная ценность: Способствует биологическому снижению рисков за счет сохранения естественной кинетики сигналинга TCR и исключения артефактов, связанных с гиперэкспрессией.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание валидированных биологических систем с определенной специфичностью TCR для стандартизированных анализов иммунных клеток.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимой подготовки популяций Т-клеток для последующих рабочих процессов скрининга с помощью изоляции методом FACS и SCNT.
- Научная ценность: Поддержка стандартизации анализа путем обеспечения постоянного ввода антигенспецифических Т-клеток на основе эндогенной экспрессии TCR.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует согласованию трансляционных биомаркеров путем моделирования Т-клеточных ответов человека на такие патогены, как Toxoplasma gondii.
- Практическая ценность: обеспечивает непрерывность процесса от стадии поиска до доклинической валидации с использованием экспрессии эндогенных TCR у химерных мышей.
- Научная ценность: поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков, обеспечивая функциональную валидацию специфичности TCR с помощью PAX и тетрамерного анализа.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Модель Т-клеточного рецептора, полученная методом SCNT, интегрируется в континуум разработки — от валидации мишени до доклинических исследований, обеспечивая снижение механистических рисков и прогностическую уверенность в эффективности терапии, направленной на иммунную систему.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей с использованием T-клеток с заранее определенной специфичностью к инфекционным агентам.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа и получение количественных данных с помощью T-клеток, специфичных к патогенам и очищенных методом FACS, которые используются в SCNT.
- Аналитика: Предоставляет измеримые результаты с помощью анализа PAX и окрашивания тетрамерами для подтверждения специфичности TCR и отслеживания иммунных ответов.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность доклинических исследований с использованием химерных мышей, экспрессирующих эндогенные TCR, для мониторинга иммунного ответа при соответствующих заболеваниях.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для генерации моделей с определенным TCR для портфелей исследований аутоиммунных заболеваний, рака и инфекционных болезней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет физиологической экспрессии TCR и снижение механистической неопределенности при иммунном таргетировании.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря экспрессии в эндогенном локусе и рабочим процессам изоляции на основе FACS.
- Стратегическая ценность: Принятие более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки за счет снижения биологических рисков на поздних стадиях создания иммунотерапии и вакцин.
- Влияние на портфель: Приоритизация мишеней с учетом рисков с использованием валидированных, релевантных заболеванию моделей Т-клеток с определенной специфичностью.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области переноса ядер соматических клеток, культивирования эмбриональных стволовых клеток и методов иммунологической валидации.
- Зависит от наличия систем микроманипуляции, оборудования для работы с ооцитами и инфраструктуры для инъекций в бластоцисты.
- Необходимо согласование стандартов между группами иммунологии, биологии развития и центрами по созданию трансгенных моделей.
- При адаптации следует учитывать применимость модели к различным линиям мышей и эффективность изоляции Т-клеток, специфичных для конкретных патогенов.
- Практические ограничения включают скорость формирования бластоцист и эффективность получения эмбриональных стволовых клеток после SCNT, как указано в протоколе.
