Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений

Здравствуйте, я Раджа Ти, докторант Института сердца и диабета Baker IDI. Я проведу вас по этапам 3D-иллюстрации модификации эпигенетики, которая отмечает повреждение ДНК и конденсацию хроматина в кардиальной клетке. ДНК обернута вокруг ядерных зон.

Каждая нуклеосома состоит из четырех различных типов гистонов: H2A, H2B, H3 и H4. Образование разрывов ДНК сопровождается фосфорилированием H2AX. Это фосфорилирование H2AX происходит преимущественно в хроматине, который характеризуется метилированием H3K4. Теперь мы рассмотрим 3D-иллюстрацию модификаций в вашей клетке с иммуномаркировкой фосфорилированного H2AX и метилированного H3K4.

Приступим к работе. Сначала поместите определенный объем клеточной суспензии в 15 мл пробирки Falcon; промойте их дважды с помощью PBS, центрифугируя при 150 G, и ресуспендируйте.

Переведите клетки в свежую среду, чтобы наблюдать за непосредственным влиянием радиации на клеточные процессы. Держите клетки на предметных стеклах от 5 до 10 минут до и во время облучения. Подвергните клетки воздействию гамма-излучения или рентгеновских лучей. После облучения распределите по 3 мл клеточной суспензии в каждую из шести лунок GU.

Планшет для определения пика γ-H2AX; инкубируйте клетки от 30 минут до одного часа при 37 °C. Мы используем систему Cytospin для нанесения неадгезивных клеток на предметные стекла. При сборке зажима Cytospin убедитесь, что весь фильтровальный картон совпадает с воронкой.

Раздайте по 50 µL данной клеточной суспензии в каждую лунку цитоспина, поместите кассеты цитоспина в устройство Cytocentrifuge и центрифугируйте при 500 RPM в течение пяти минут. Извлеките кассеты и отделите предметные стекла от фильтровальной карты. Не допускайте длительного высыхания клеток на воздухе, так как это может повлиять на фон при флуоресцентном окрашивании.

С помощью жидкого блокирующего маркера обведите кругом каждый мазок, затем зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение пяти минут. По сравнению с этанолом или маслом, при использовании 4% параформальдегида наблюдалась лучшая фиксация. Промойте предметные стекла с PPS-покрытием и пермеабилизируйте клетки Triton X 100 при комнатной температуре в течение пяти минут.

По сравнению с Twin 80, мы наблюдали более выраженный сигнал в клетках при использовании Triton X 100. Наблюдайте за клетками с PP S3 трижды по пять минут. Блокируйте клетки в 1% BSA в течение 10 минут при комнатной температуре и повторите эту процедуру три раза; данные результаты сравнивались с другими блокирующими агентами и временем выдержки.

BSA оказался наиболее эффективным средством для минимизации неспецифического связывания первичных антител; мы использовали два первичных антитела, разведенных 1:500 в 1% BSA, нанося примерно 50 µL первичного антитела на каждый предметное стекло. Инкубация с первичными антителами при комнатной температуре в течение 60 минут снижает фоновое окрашивание по сравнению с инкубацией в течение ночи при 4 °C. Промойте клетки трижды в PBS по пять минут.

Alexa floor 4 88 эффективно работает против мышиных антител, а Alexa floor 5 46 — против кроличьих. Вторичные антитела использовались для одновременного выявления различных маркеров. Используйте антитела, полученные в разных видах животных.

Добавьте примерно 50 µL разведенного вторичного антитела на каждый предметное стекло. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 90 минут. Рекомендуется проводить инкубацию клеток во влажной камере, чтобы предотвратить высыхание клеток и антител. Промойте стекла раствором PBS 3 раза по пять минут каждое.

На каждый предметный стеклo добавляли 50 µL разведения topo three в PBS в пропорции 1:500. Слайды промывали PBS трижды по пять минут. Удаляли излишки влаги с предметных стекол и добавляли раствор Antifa.

Рекомендуется не высушивать клетки полностью перед добавлением раствора Antifa. Поместите покровное стекло на предметное стекло. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха.

Оставьте предметные стекла на ночь в темной влажной камере. Загерметизируйте стекло бесцветным лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание клеток. Изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа, показывают.

Для достижения лучшего пространственного разрешения при сборе изображений использовался гелиевый лазер. Предпочтительнее использовать иммерсионный объектив 63x с масляным погружением, чем объективы с более высоким или низким увеличением. Коэффициент масштабирования три или четыре позволит получить изображение с более высоким разрешением.

Для учета FO в большом количестве клеток предпочтительно использовать скорость сканирования 8 и размер изображения 1024 на 1024 пикселя на клетку. При получении изображений в нескольких каналах рекомендуется использовать последовательное построчное сканирование вместо покадрового. Чтобы избежать выцветания образца, усиление детектора и смещение усилителя настраиваются таким образом, чтобы снизить уровень шума и насыщение сигнала.

Поскольку размер Kama HX X four может быть менее 0.5 micrometers, рекомендуется получать изображения с разрешением не менее 0.5 micrometer. Для получения серии снимков вдоль оси струи при использовании паттернов mark first и mark lost требуется определить размер шага. Для иллюстрации пространственного расположения различных белков рекомендуется использовать скорость сканирования six при размере изображения 2048 And 2 48 pixels с применением metamor first.

Второй вариант — подсчет по изображениям, полученным на различных конфокальных микроскопах. Откройте теги изображений gamma hgx либо напрямую через меню файлов, либо используя номера счетов. Перейдите в меню Process («Обработка») и выберите Stack arithmatic («Арифметика стека»).

Выберите «максимальную проекцию» (maximum projection) и отметьте плоскости, которые необходимо включить. Нажмите «ОК». Теперь выберите «top hat» и в качестве исходного изображения укажите изображение Gamma H two X, затем примените настройку.

Фильтр-«цилиндр» (Top hat) и полученное в результате изображение будут представлять собой бинарное изображение с меньшим уровнем шума и уменьшенной вариацией интенсивности фокусов. Перейдите в раздел «Области» (Regions), выберите инструмент рисования областей и обведите ядра. Перейдите в меню «Процесс» (Process) и выберите «Пороговая обработка изображения» (Threshold image).

Выберите порог включения и установите значения нижнего и верхнего порога. Как правило, именно значения порога влияют на итоговое количество. Оптимальное значение порога — то, которое минимизирует включение фона и максимизирует включение исследуемого объекта.

Наилучшим образом этого можно добиться, подсчитывая количество выходов (foray), используя различные значения порога. Затем сравните количество выходов, полученное таким образом, с результатами подсчета на глаз. Выберите DPI-изображение, перейдите в меню регионов (regions) и выберите опцию переноса регионов (transfer regions).

Теперь у нас есть соответствующие изображения грибного тела и ядер, готовые для подсчета. Большинство областей ядер перенесены в top hat. Перейдите в меню Measure и выберите Integrated Density Analysis или IMA; выберите Measure all regions и нажмите на measure, чтобы получить число FTE.

Теперь количество FTE для каждого региона можно экспортировать в электронную таблицу, используя опцию Log data. Откройте ранее созданные изображения jet projector для каждого канала. Перейдите в меню display и выберите color align.

Выберите соответствующие исходные изображения для каждого канала, чтобы создать совмещенное изображение для всех трех каналов. Анализ профиля сканирования по линии выполняется для иллюстрации пространственного расположения различных маркеров в ядре. В панели инструментов измерения выберите команду «Line scan analysis» (анализ профиля сканирования по линии) и проведите линию через клетку.

Это позволит создать график, отображающий интенсивность флуоресценции каждого канала вдоль линии, что представляет собой расстояние между различными маркерами относительно друг друга. Чтобы создать 3D-изображение из стека, перейдите в меню «Stack» и выберите «3D reconstruction». В качестве типа 3D-реконструкции выберите «maximum».

Выберите плоскость вращения и установите расстояние калибровки струи. Обычно пользователь подтверждает выбор нажатием кнопки «ОК» для создания 3D-реконструкции. На этом наш протокол иммунофлуоресцентного окрашивания и анализа изображений завершен.

Подводя итог, иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия представляет собой метод трехмерной визуализации различных маркеров C и фокусов gamma H2AX в клеточном ядре. Спасибо за просмотр.