Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

Общая цель данной процедуры заключается в сочетании метода отбора проб свежей продукции с помощью клейкой ленты с полноклеточным молекулярным детектированием видов salmonella с использованием экспресс-метода флуоресцентной гибридизации in situ, также известного как FISH. Это достигается путем первоначального приклеивания липкой ленты к исследуемому материалу и извлечения клеток, связанных с поверхностью. Ленты с захваченными клетками могут быть проанализированы напрямую либо подвергнуты обогащению в твердой или жидкой фазе.

Второй этап процедуры представляет собой фиксацию на ленте и дегидратацию в серии этанола для клеток, введенных в бульон или обогащенных в нем. Второй этап включает фиксацию клеток в суспензии с последующим повторным суспендированием клеток в буфере для хранения. Третий этап процедуры заключается в проведении экспресс-гибридизации на ленте с использованием коктейля олигонуклеотидных зондов, специфичных для salmonella, с последующим удалением избытка зонда путем промывки промывочным буфером; для образцов, анализируемых методом FISH, этап гибридизации проводится в суспензии, а избыток зонда может быть удален с помощью простого разведения перед анализом.

Заключительным этапом процедуры является докрашивание гибридизированных клеток, закрепленных на ленте, с помощью DPI и их исследование методом флуоресцентной микроскопии. Для анализа, основанного на фактических данных, докрашивание не требуется. В конечном итоге данный метод обеспечивает возможность визуального или цитометрического обнаружения видов Salmonella, которые могут присутствовать в пробах свежих продуктов.

Идея этого метода впервые пришла мне в голову при чтении статьи итальянской группы, которая использовала аналогичный подход для изучения бактериальных сообществ на римских реликвиях из пористого камня. Затем мы с r провели обсуждение этой работы на курсе по экспресс-методам в микробиологии пищевых продуктов, который я преподавал. Спустя несколько недель началась вспышка сальмонеллеза, источником которой стали свежие овощи и фрукты; в итоге заболели почти 1500 человек в 43 различных штатах.

Хотя наш экспериментальный подход представляет собой своевременный и практичный способ обнаружения специфических типов бактерий на свежих продуктах, он также достаточно компактен для проведения тестирования в полевых условиях или на пищевом производстве. Начните с выбора ленты для отбора проб. В качестве вариантов можно использовать имеющиеся в продаже ленты для сбора грибков или контактные ленты, которые стерильны и упакованы для удобства использования.

С помощью перманентного маркера и стерильного алюминиевого шаблона нанесите квадраты размером 1 см на нелипкую сторону отрезка клейкой ленты длиной 10 см. Они будут служить визуальным ориентиром для отметки того, какая часть ленты была использована для взятия пробы с пищевого продукта или поверхности окружающей среды. Сформируйте из ленты петлю в форме буквы С, направив липкую сторону к поверхности, с которой берется проба. Для этого удерживайте липкие концы большим и средним пальцами, прижав указательный палец к нарисованному квадрату на обратной стороне ленты.

Приложите ленту к поверхности, с которой необходимо взять пробу, и осторожно прижмите отмеченную область к поверхности, не отпуская края ленты. С помощью указательного пальца убедитесь, что липкая сторона ленты полностью контактирует с поверхностью образца. Чтобы избежать образования пузырьков, прижимайте ленту равномерным движением.

Медленно отделите ленту от образца. Физическое извлечение микробов, связанных с поверхностью, фиксирует клеточный заряд. Приклейте ленту липкой стороной вверх к предметному стеклу микроскопа. Используйте обычную прозрачную офисную ленту, обеспечивая надлежащее натяжение и растяжение ленты для создания плоской поверхности без складок.

Это поможет свести к минимуму проблемы с деформацией или скручиванием ленты при последующем нагревании. Во время гибридизации поместите ленту лицевой стороной вниз на подложки Xylose Slicing Tertile 4 или XLT 4 Agri, чтобы исследуемые клетки находились в прямом контакте с поверхностью Agri, что облегчит последующее отделение ленты от поверхности Agri.

После обогащения часть ленты с шаблонизированным образцом плотно прижимают к поверхности агара, слегка приклеив один конец ленты. Чашки Петри переворачивают вверх дном, чтобы избежать конденсации, и инкубируют при 35 °C. Для обеспечения достаточного роста видов salmonella продолжительность периода инкубации, необходимого для обогащения клеток до детектируемого уровня, будет зависеть от исходного уровня загрязнения salmonella.

По истечении требуемого периода обогащения откройте чашку с агаром; лента сохранит свою клейкость в течение инкубации. Осторожно прижмите ленту к агару указательным пальцем, чтобы обеспечить максимальный сбор микроколоний, образовавшихся на границе раздела ленты и агара, затем захватите ленту за край, прикрепленный к стенке чашки Петри, и медленно и равномерно снимите ее. С помощью обычной прозрачной офисной скотч-ленты закрепите ленту с захваченным клеточным зарядом на предметном стекле липкой стороной вверх так, чтобы поверхность была плоской и без складок.

Проведите фиксацию клеток на ленте в течение 30 минут при 25 °C, покрыв область контакта образца 500 µL 10% нейтрального буферного формалина. Слейте фиксатор в герметичный контейнер под вытяжным шкафом, чтобы минимизировать воздействие раздражающих или токсичных паров; промойте ленту один раз в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS), осторожно залив поверхность ленты PBS, после чего дегидратируйте образец. Используя серию возрастающих концентраций этанола, приготовьте буферы для прегибридизации, гибридизации и промывки, используя коммерческие растворы степени чистоты для молекулярной биологии; профильтруйте их через шприцевой фильтр 0,22 µm и предварительно нагрейте буферы для гибридизации и промывки до 55 °C.

Добавьте флуоресцентно меченные олигонуклеотидные зонды в предварительно нагретый буфер для гибридизации до конечной концентрации зонда 5 нг/мкл. Нанесите 300 мкл буфера для гибридизации, содержащего коктейль зондов, на область контакта ленты с темплатированным образцом. Инкубируйте связанные с лентой гибридизованные клетки во влажной герметичной инкубационной камере при 55 °C, используя инкубатор прямого контакта, такой как прибор в режиме для предметных стекол, в течение 15 минут. После гибридизации извлеките предметные стекла и удалите слой буфера для гибридизации с зондами. Кратковременно и осторожно промойте образец, аккуратно перенося предварительно нагретый промывочный буфер с помощью пипетки.

Нанесение небольшого объема буфера на предметное стекло под наклоном позволяет высушить образцы на воздухе для последующего обнаружения видов salmonella с помощью флуоресцентной микроскопии. Нанесите на предметное стекло около 10 microliters Vector Shield H 1200 — среды для заключения препаратов, содержащей dpi в качестве ядерного контрастного красителя; инкубируйте в темноте в течение 10 минут. Нанесите иммерсионное масло на покровное стекло и исследуйте образцы, используя объектив с большим увеличением для масляной иммерсии.

Фильтр DPI используется для наведения образца в фокус. Затем микроскоп переключается на соответствующий фильтр, и клетки salmonella подсчитываются визуально по зеленой или красной флуоресценции, в зависимости от того, какой краситель использовался для маркировки зондов. Для цитометрического анализа перенесите образцы, суспендированные в PBS, в пробирки для отбора проб с круглым дном объемом 5 мл и исследуйте их с помощью проточного цитометра с возбуждением при 647 нм.

Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения FlowJo. Отбор проб с поверхности искусственно контаминированного томата с использованием адгезивной ленты для выявления Terica serovar, Ty Murium позволяет проводить прямой анализ после фиксации методом микроскопии или проточной цитометрии. Ленты обрабатывали для экспресс-флуоресцентной гибридизации in situ с использованием комбинации специфических ДНК-зондов на Salmonella, меченных Texas Red, в зависимости от исходной локальной концентрации клеток Salmonella на ленте.

Обогащение на твердой фазе дало результаты от изолированных микроколоний до сливного роста. Клетки, собранные с помощью ленты, могли быть проанализированы с использованием комбинированного метода FISH и проточной цитометрии либо непосредственно после отбора проб, либо после пятичасового культивирования в жидкой среде на поверхности. Обогащение в миникультурах при 35 °C.

Несмотря на то, что мы описали применение метода «ленты-фильтра» для обеспечения безопасности пищевых продуктов, данный метод также обладает хорошим потенциалом для использования в других дисциплинах, включая экологическую микробиологию, фитопатологию или клиническую микробиологию. Параллельно с данной процедурой можно проводить дополнительные эксперименты, такие как биохимическое тестирование или ПЦР, используя обогащения в твердой или жидкой фазе из образцов, извлеченных с ленты. Эти тесты могут быть использованы для получения ответов на вопросы о наличии Salmonella, которые выходят за рамки данной процедуры с использованием рыбы.