Бактериальные обнаружения и идентификации с использованием электрохимических датчиков

Общая цель следующего эксперимента заключается в обнаружении и идентификации бактерий с помощью электрохимических сенсоров. Это достигается путем первоначального высвобождения рибосомальной РНК из бактерий для обеспечения гибридизации с фторированным детекторным зондом; на втором этапе рибосомальная РНК, связанная с детекторным зондом, добавляется к рабочему электроду, что позволяет ей гибридизоваться с захватывающим зондом на поверхности сенсора. Затем антифлуоресцеиновый конъюгат с пероксидазой хрена связывается с фторированным детекторным зондом.

Наконец, можно получить интерферометрический ток, интенсивность которого коррелирует с количеством комплексов захватывающего рибосомального зонда и детектирующего зонда рРНК на поверхности сенсора. Основным преимуществом данного метода по сравнению с культуральными методами является то, что бактерии могут быть обнаружены и идентифицированы примерно за 45 минут, что позволяет избежать многочасового ожидания, необходимого для формирования бактериями видимой колонии на чашке с агаром. Применение этой методики позволит улучшить тактику лечения инфекционных заболеваний.

Поскольку раннее обнаружение бактериальных патогенов имеет решающее значение для таргетной антибиотикотерапии и улучшения клинических исходов, данный метод является полезным для диагностики инфекционных заболеваний, а также может быть применен для решения других диагностических задач, таких как иммунодиагностика. Начните с инкубации разбавленного захватывающего зонда с гександекандитиолом в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить восстановление тиольной группы захватывающего зонда, что позволит получить более воспроизводимые результаты.

После инкубации обдуйте массив из 16 сенсорных чипов с золотым напылением струей азота в течение пяти секунд, чтобы удалить влагу или посторонние частицы. Малые объемы жидкости следует осторожно наносить на рабочий электрод в сенсорном массиве. Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение.

Поскольку правильное выполнение дозирования, промывки и сушки значительно снижает вариабельность между чипами, на следующем этапе нанесите 6 µL смеси разведенного зонда захвата HDT на рабочий электрод всех 16 сенсоров сенсорной матрицы и храните чипы сенсоров в закрытой чашке Петри при температуре 4 °C в течение ночи. На следующий день промойте чипы сенсоров деионизированной водой в течение 2–3 с, а затем высушите чипы струей азота в течение 5 с. Теперь нанесите 6 µL раствора гидрохлорида, NaCl, EDTA и меркаптоэтанола на рабочий электрод всех 16 сенсоров и инкубируйте сенсоры в течение 50 мин в чашке Петри при комнатной температуре.

Для подготовки образцов к анализу с помощью электрохимического сенсора перенесите один миллилитр бактериальной культуры в логарифмической фазе роста в микроцентрифужную пробирку, затем центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 16,000 gs. Обратите внимание, что работа с патогенными бактериями должна проводиться в боксе биологической безопасности.

После удаления супернатанта нанесите кончиком пипетки 10 µL 1 M гидроксида натрия на дно микроцентрифужной пробирки и несколько раз произведите аспирацию и вытеснение жидкости для полного ресуспендирования осадка. После инкубации суспензии при комнатной температуре в течение пяти минут добавьте 50 µL PBS, содержащего бычий сывороточный альбумин (BSA) и модифицированный флуоресцеином детектирующий зонд, для нейтрализации бактериального лизата. Затем инкубируйте нейтрализованный лизат в течение 10 минут при комнатной температуре.

Начните этот этап с промывки одного из подготовленных сенсорных чипов деионизированной водой в течение двух-трех секунд, чтобы удалить раствор меркаптоэтанола. После высушивания чипа, как было показано ранее, нанесите 4 µL нейтрализованного лизата бактерий на рабочие электроды. 14 из сенсоров.

Затем нанесите четыре microliters связывающего олигонуклеотида в PBS с BSA и флуоресцеин-модифицированным детекторным зондом на два сенсора положительного контроля. После инкубации лизата и сенсоров положительного контроля в течение 15 minutes промойте и высушите весь сенсорный чип, как описано ранее. Теперь нанесите четыре microliters антифлуоресцеиновой пероксидазы хрена (HRP) в PBS с казеином на рабочие электроды всех 16 сенсоров.

После 15-минутной инкубации промойте и высушите сенсорный чип. Затем наклейте стикер для лунок на поверхность сенсорного чипа и установите чип в держатель; с помощью пипетки нанесите по 50 µL субстрата TMB на все 16 сенсоров и закройте держатель сенсорного чипа. В завершение используйте считыватель чипов Helios для получения данных пирометрии и циклической телеметрии для всех 16 сенсоров.

Описанный выше электрохимический анализ по своей структуре схож с сэндвич-ИФА; как показано на этом рисунке, гибридизация целевой рибосомальной РНК с захватывающими и детектирующими зондами регистрируется посредством окислительно-восстановительной реакции, катализируемой HRP, конъюгированной с фрагментами антител к флуоресцеину, которые связываются с флуоресцеиновым линкером на детектирующем зонде. Важным компонентом чувствительности анализа является химия поверхности золотого электрода. Золотой электрод покрыт меркаптоэтанолом и гексанолом и функционализирован путем добавления разбавленных захватывающих зондов.

Сэндвич-гибридизация целевой рибосомной РНК с захватывающим зондом и детектирующим зондом, меченным флуоресцеином, приводит к образованию комплекса, который обнаруживается путем добавления конъюгата антифлуоресцеина с пероксидазой хрена и субстрата TMB. Параметрический ток M генерируется за счет окислительно-восстановительного цикла, который возникает в результате окисления TMB пероксидазой хрена и восстановления TMB электронами с электрода. В представленных здесь анализах используется сенсорный массив на чипе gene fluidic 16.

Каждый датчик в массиве содержит три электрода — рабочий, электрод сравнения и вспомогательный, точки контакта которых расположены по краю чипа. Считыватель чипа оснащен подпружиненными контактами (pogo pins), которые соединяются с каждой из точек контакта. Считыватель чипа служит интерфейсом между массивом датчиков и потенциостатом, управляемым компьютерным алгоритмом.

Здесь представлены примеры тока электрохимического датчика. В первые несколько секунд после начала параметрических измерений ток в датчиках искусственно завышен. Из-за накопления окисленного субстрата в период времени от нанесения TMB на поверхность датчика до запуска алгоритма считывателя ток быстро достигает стационарного состояния, и в течение 60 секунд можно получить достоверные и точные показания датчика.

Вариабельность между датчиками относительно постоянна, поэтому на чипе с матрицей из 16 датчиков Gene Fluidic можно параллельно проводить 16 различных сенсорных анализов. Положительный и отрицательный контроли имеют важное значение; в качестве положительного контроля используется синтетический мостиковый ДНК-олигонуклеотид, который гибридизуется как с захватывающими, так и с детектирующими зондами и служит синтетической мишенью известной концентрации. Результаты, полученные с использованием мостикового олигонуклеотида, выполняют функцию внутреннего калибровочного контроля для минимизации вариаций между чипами.

Чем больше отрицательный ток электрода, тем выше сигнал. При тестировании захватывающих и детекторных зондов предел обнаружения следует определять путем серийного разведения образца с известной концентрацией; как показано на данном рисунке, в динамическом диапазоне анализа наблюдается линейная лог-лог корреляция между концентрацией образца и выходным сигналом.

На данных столбчатых диаграммах представлены репрезентативные результаты для образцов, содержащих Escherichia coli, Klebsiella и аммиак, которые часто обнаруживаются в моче пациентов с инфекциями мочевыводящих путей; сигналы для большинства сенсоров будут низкими и схожими, и эти отрицательные результаты могут быть объединены в качестве фонового сигнала, при этом реактивность с парой зондов KE позволяет отличить Klebsiella от E. coli. Связующий олигонуклеотид служит положительным контролем и внутренним калибровочным стандартом. Данный метод может быть применен для обнаружения антибиотикорезистентных бактерий в клинических образцах путем измерения фенотипического ответа бактерий на антибиотики.

Данный метод может быть использован для подбора оптимальной терапии для конкретного пациента. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как обнаруживать и идентифицировать бактерии путем сравнения токов в различных видоспецифических сенсорах на чипе.