Вестерн-блоттинг: Подготовка образцов для обнаружения

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать простоту выполнения вестерн-блоттинга при использовании подходящих продуктов. После подготовки образцов белки разделяются по размеру, а затем переносятся на твердую фазу. Далее белки определяются с помощью антител; использование надлежащих протоколов и высококачественных экономичных реагентов позволяет улучшить результаты вестерн-блоттинга.

Здравствуйте, я Джесси Лухан, специалист по исследованиям и разработкам в компании EMD Chemicals в Сан-Диего, Калифорния. EMD является филиалом Merck, KGAA в Дармштадте, Германия. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру вестерн-блоттинга.

Итак, приступим. Первым этапом вестерн-блоттинга является подготовка образцов. Начните подготовку образцов с осаждения клеток путем центрифугирования при низкой скорости, например, в течение пяти минут при 2 500 ×g.

После центрифугирования слейте супернатант, оставив осадок клеток. Тщательно ресуспендируйте клетки в реагенте для экстракции белков cyto buster, используя 150 µL на 10⁶ клеток. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем центрифугируйте образец в течение пяти минут при 16 000 ×g и температуре four degrees Celsius. Перенесите очищенный SNA в новую пробирку и приступайте к анализу. После определения концентрации белка в образце подготовьте его для нанесения на гель с целью денатурации белка.

Используйте буфер для образцов, содержащий ионный денатурирующий детергент, такой как додецилсульфат натрия или SDS. Прокипятите смесь при температуре от 95 до 100 °C в течение пяти минут. С помощью коммерчески доступного готового геля можно быстро разделить белки по их молекулярной массе.

Заполните электрофорезную камеру рабочим буфером, который можно приготовить из реагентов химической линейки Omni PU. В первую лунку нанесите белковый маркер Trail Mix. Этот маркер имеет три контрольные полосы, которые позволяют осуществлять мониторинг в процессе электрофореза.

После окрашивания геля становятся видны 10 полос в диапазоне от 10 до 225 килоДальтонов. Внесите денатурированный образец в оставшиеся лунки. Проведите электрофорез в геле при напряжении 220 вольт в течение одного часа.

После разделения белков окрасьте гель кумасси синим, используя экспресс-краситель и ультрачувствительный краситель (готовый к использованию, без SDS), чтобы убедиться, что белки мигрировали равномерно и единообразно. Окрашивание необходимо, поскольку белки, обладающие электрическим зарядом, могут перемещаться через гель в электрическом поле, что позволяет перенести их в электрическом поле с геля на мембрану, такую как нитроцеллюлозная или PVDF. При использовании PVDF-мембран погрузите мембрану в метанол на несколько минут, после чего уравновесьте ее в ледяном трансферном буфере в течение пяти минут. Также погрузите гель на несколько минут в ледяной трансферный буфер; такое уравновешивание предотвращает усадку геля во время переноса.

Для проведения влажного переноса соберите «сэндвич», поместив гель и мембрану между губками и бумажными фильтрами. Плотно зажмите сборку, предварительно убедившись в отсутствии пузырьков воздуха между гелем и мембраной. Погрузите «сэндвич» в буфер для переноса и приложите электрическое поле.

Отрицательно заряженные белки будут перемещаться к положительно заряженному электроду. Затем мембрана останавливает их, связывает и препятствует их дальнейшему продвижению. После завершения переноса проведите визуализацию белков, чтобы убедиться в равномерности переноса и отсутствии воздушных пузырьков.

Это можно легко сделать с помощью красителя Red Alert для вестерн-блоттинга. Данный краситель готов к использованию, а обесцвечивание легко проводится с помощью воды. На изображении представлен гель после обесцвечивания путем промывки в воде; перед инкубацией мембраны с антителами ее подвергают блокировке.

Для предотвращения неспецифического связывания заблокируйте мембрану с помощью высококачественных блокирующих реагентов. Чтобы избежать повышения фона, инкубируйте мембрану в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре при осторожном перемешивании, после чего промойте мембрану трижды в TBST или PBST. Эти буферы можно легко и удобно приготовить с использованием соответствующих таблеток TBS-Tween и PBS-Tween.

После блокировки и промывки мембрану можно инкубировать с первичными антителами. Для нанесения первичных антител используйте раствор Signal Boost, который позволяет значительно усилить сигнал. Приготовьте раствор первичных антител в растворе 1 и инкубируйте мембрану в течение одного часа.

После инкубации дополнительно добавлять блокирующие агенты не требуется. Промойте мембрану раствором TBST. Затем инкубируйте мембрану с вторичными антителами, разведенными в растворе два системы signal boost, в течение одного часа.

Наконец, еще несколько раз промойте мембрану буфером TBST перед конъюгацией с HRP. Для детекции вторичных антител здесь традиционно используется усиленная хемолюминесценция или ECL. Используется экспресс-реагент ECL, так как он не требует смешивания люминола или усилителя.

Просто распылите раствор на мембрану несколько раз, инкубируйте в течение двух минут и проявите с использованием рентгеновской пленки. Метод Rapid Step обеспечивает чувствительность на уровне низких пикограмм, а также более слабую эмиссию в течение до двух часов после добавления субстрата. Маркеры белков Trail mix позволяют отслеживать белки в процессе электрофореза по сравнению со стандартными протоколами вестерн-блоттинга.

Усиление сигнала обеспечивает более широкий динамический диапазон и повышенную чувствительность. Наконец, максимально высокую чувствительность можно достичь, используя реагенты Rapid вместо традиционных реагентов для ECL. Мы только что продемонстрировали вам, как эффективно и экономично проводить вестерн-блоттинг, используя широкий ассортимент продукции.

Помните, что качество ваших результатов зависит от качества используемых реагентов. На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.