Анализ мРНК ядерного Кинетика Экспорт в клетках млекопитающих по Микроинъекция

Общая цель данной процедуры заключается в измерении кинетики ядерного экспорта мРНК в клетках млекопитающих. Это достигается путем микроинъекции мРНК или ДНК в ядра клеток культур тканей млекопитающих с последующей фиксацией образцов после различных периодов инкубации.

Затем мРНК окрашивают с помощью флуоресцентной гибридизации in situ или FISH. Заключительным этапом процедуры является получение изображений клеток и количественная оценка интенсивности флуоресценции в цитоплазме и ядре. В конечном итоге скорость экспорта мРНК можно измерить, сочетая микроинъекции и флуоресцентную микроскопию.

Здравствуйте, я SRG AV из лаборатории Алекса Палаццо кафедры биохимии Университета Торонто. Я Стефан Тоски, также из лаборатории Палаццо. Я Эми из лаборатории Палаццо, а я Кхи Маха Дэвид из лаборатории Палаццо.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру введения мРНК в ядра клеток культур тканей млекопитающих методом микроинъекции. Мы также покажем, как окрашивать мРНК с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Мы используем эти методы в нашей лаборатории для изучения кинетики ядерного экспорта мРНК в клетках млекопитающих.

Итак, приступим. Перед микроинъекцией доведите концентрацию предварительно подготовленной плазмидной ДНК до значения от 50 до 200 µg/mL в буфере для инъекций. Затем добавьте в смесь Oregon Green 488 (OG), конъюгированный с 70 kDa декстраном, чтобы обеспечить идентификацию инъецированных клеток.

Конъюгированный декстран OG поможет определить, какое количество жидкости было введено в ядро, а какое просочилось в цитоплазму. Центрифугируйте образцы при 13 000 G и температуре четыре градуса Цельсия в течение не менее 20 минут, чтобы осадить любые твердые частицы, которые могут перекрыть кончик иглы. Выберите линию клеток млекопитающих для микроинъекции на основании критериев, описанных в письменном протоколе.

Для данной демонстрации используются семь клеток. Клетки высевают на промытые кислотой покровные стекла в чашки Петри диаметром 30 мм не менее чем за 24 часа до микроинъекции. В идеале на момент инъекции монослой клеток должен быть конфлюэнтен примерно на 70–90%, чтобы облегчить идентификацию инъецированных клеток; перед инъекцией в монослое клеток создают повреждение, используя пластиковый наконечник пипетки объемом 200 µL.

Сделайте крестообразный надрез на покровном стекле и оставьте клетки для восстановления в инкубаторе для культивирования тканей минимум на 15 минут перед инъекцией. Для микроинъекций используйте инвертированный микроскоп, установленный на пневматическом столе для минимизации вибраций, которые могут нарушить процесс микроинъекции. С помощью наконечника для нанесения геля удалите примерно 1 µL со поверхности центрифугированного образца, чтобы избежать разрушения осадка.

Введите кончик пипетки в заднюю часть готовой иглы для микроинъекций и выдавите жидкость. Жидкость будет втянута в кончик иглы за счет капиллярного эффекта. В течение 5–30 секунд вблизи кончика должен появиться видимый мениск.

Поместите заполненную жидкостью иглу в держатель и закрепите его на микроманипуляторе. Под углом 45 градусов визуализируйте иглу с помощью объектива 10x и расположите ее в центре поля зрения рядом с фокальной плоскостью. С помощью грубых ручек микроманипулятора переместите иглу; держатель соединен трубкой со стеклянным шприцем, который используется для создания давления, необходимого для извлечения жидкости из кончика иглы.

Для поддержания постоянного давления шприц закрепляют на трубном зажиме. С помощью двух резиновых пробок и двух металлических зажимов приподнимите иглу на несколько миллиметров, чтобы предотвратить ее повреждение на последующих этапах, после чего отодвиньте микроскоп назад. Увеличьте давление, нажав на поршень шприца.

от 0,5 до двух кубических сантиметров. Поместите чашку Петри, содержащую покровное стекло с поврежденным монослоем. На смотровом столе отодвиньте микроскоп назад.

Переместите стойку вперед в вертикальное положение так, чтобы конденсатор был совмещен с иглой для ее погружения в жидкость. Это следует делать осторожно, чтобы игла не сломалась о покровное стекло. С помощью объектива 10x найдите центр перекрестного среза и расположите иглу над клетками, в которые будет производиться инъекция.

Увеличьте увеличение, переключившись на объектив 40 x. Затем опустите и центрируйте иглу с помощью ручек микропривода на джойстике. Начните инъекцию с одного угла перекрестия раны, опуская иглу до контакта с ядром.

После инъекции фазовый блеск клетки заметно изменяется. Продолжайте движение вдоль одного края перекрестия раны. Для легкой идентификации инъецированных клеток при визуализации крайне важно, чтобы давление при впрыскивании было правильно отрегулировано для каждой иглы.

Давление должно быть достаточно высоким, чтобы пробить плазматическую и ядерную мембраны, но не настолько сильным, чтобы привести к гибели клеток. Выполняйте микроинъекции в клетки вдоль края раны в течение фиксированного периода времени. При наличии навыка за этот интервал можно ввести вещества в несколько сотен клеток.

Если вы вводите плазмидную ДНК, перед фиксацией инкубируйте микроинъектированные клетки при 37 °C в инкубаторе для культур тканей в течение 20 минут, затем прекратите транскрипцию. Для этого обработайте клетки раствором α-амантином в концентрации 1 µg/mL в ростовой среде. Такая концентрация эффективно ингибирует транскрипцию с микроинъектированных плазмид.

Верните клетки в инкубатор и дайте им экспортировать вновь синтезированную мРНК. Одну и ту же иглу можно повторно использовать для инъекций в несколько покровных стекол. Тем не менее, иглу необходимо заменить при смене типа микроинъекционной ДНК или РНК.

Кроме того, после извлечения иглы из диспенсера ее следует утилизировать для обеспечения точности измерения кинетики ядерного экспорта мРНК. Отдельные образцы следует фиксировать через 0 минут, 15 минут, 30 минут, 60 минут и 120 минут. После обработки альфа-манином в соответствующее время аспирируйте питательную среду и дважды промойте клетки двумя миллилитрами раствора PBS.

Важно поддерживать покровные стекла влажными, сводя к минимуму время их пребывания вне жидкости. Фиксируйте клетки, добавив 2 мл 4% раствора альдегида в PBS, и инкубируйте клетки не менее 15 минут при комнатной температуре. После еще двух промывок фиксированных образцов сделайте клетки проницаемыми, добавив 2 мл 0,1% Triton X 100 в PBS; повторно инкубируйте клетки не менее 15 минут при комнатной температуре.

Наконец, промойте образцы еще дважды, чтобы подготовить их к гибридизации. Дважды промойте клетки промывочным буфером из раствора 1 XSSC, содержащего от 25 до 60% formamide. Затем подготовьте камеру окрашивания для гибридизации, налив воду на дно чашки Петри диаметром 150 мм и аккуратно поместив на поверхность воды фрагмент paraform.

Удалите воду, перевернув чашку, чтобы параформ прикрепился к её дну. Вручную удалите все пузырьки воздуха с каждого покровного стекла, предназначенного для окрашивания. Нанесите пипеткой капли гибридизационного раствора объемом 100 µL на параформ.

Обратите внимание, что количество форmage следует оптимизировать для конкретного используемого белка рыбы с помощью пинцета. Извлеките покровное стекло с фиксированными клетками из чашки Петри диаметром 30 миллиметров. С помощью фильтровальной бумаги Whatman промокните обратную сторону покровного стекла и удалите излишки буфера с лицевой стороны, не допуская высыхания клеток.

Затем положите покровное стекло срезом вниз на раствор FISH. Повторите эту процедуру для каждого покровного стекла. После того как крышка камер для окрашивания будет закрыта, инкубируйте образцы от 5 до 18 часов при 37 °C.

Подготовьте несколько промывочных камер таким же образом, как была подготовлена камера для окрашивания; с помощью пипетки нанесите один миллилитр промывочного буфера на парафильм промывочной камеры. После инкубации извлеките покровные стекла из камеры для окрашивания, добавив один миллилитр промывочного буфера. Жидкость должна затечь под каждое стекло за счет капиллярного эффекта.

Затем снимите покровные стекла с помощью пинцета и поместите каждое из них в каплю промывочного буфера, выдержанного при комнатной температуре в течение пяти минут. Промойте каждое покровное стекло еще дважды, чтобы общее количество промывок для каждого стекла составило три. Пипеткой нанесите от 10 до 30 µL закрепляющего раствора с DAPI на предварительно промытый предметный слайд. На один слайд с помощью пинцета и фильтровальной бумаги Whatman можно поместить два покровных стекла.

Высушите обратную сторону покровных стекол и удалите излишки жидкости с лицевой стороны, не пересушивая образцы. Поместите каждое покровное стекло лицевой стороной вниз на каплю закрепляющего раствора. Закрепленные образцы можно хранить при температуре 4 °C.

Здесь показано влияние альфа-мантина на транскрипцию введенной плазмидной ДНК в фибробластах NIH 3T3, которые были предварительно обработаны различными концентрациями альфа-мантина. В клетки вводили плазмидную ДНК TFL s delta i и конъюгированный с OG 70 килоДальтон декстран. Каждая строка соответствует одному полю зрения, в котором визуализировали OG 70 килоДальтон декстран и мРНК T uts delta I.

Очевидно, что высокие концентрации препарата полностью подавляли продукцию транскрипта T UTS delta I, тогда как при более низких концентрациях этого не наблюдалось. Представлен временной ход стоимости ядерного экспорта мРНК. В семь клеток были введены плазмидная ДНК T UTS delta i и конъюгированный с OG декстран с молекулярной массой 70 килДальтон.

Через 30 минут после инъекции клеток их обрабатывали альфа-мантином и инкубировали при 37 °C в течение 0 минут, 60 минут и 120 минут. Затем клетки фиксировали и окрашивали зондом против мРНК T UTS delta I, а также антителами к маркеру ЭПР trap alpha; каждая строка соответствует одному полю клеток.

Для получения информации о том, как количественно определить экспорт мРНК, пожалуйста, обратитесь к онлайн-тексту здесь. Временная точка 120 минут была увеличена. Для демонстрации колокализации мРНК TFS delta I в ЭР показано наложение мРНК T UTS delta I (зеленым цветом) и trap alpha (красным цветом). Информацию о том, как проводить совместное окрашивание мРНК и белков, можно найти в онлайн-тексте.

Мы только что продемонстрировали вам способ измерения кинетики ядерного экспорта мРНК с помощью микроинъекций. При выполнении этой процедуры важно помнить, что успешная микроинъекция требует надлежащей подготовки. Такие ключевые этапы, как подготовка образцов ДНК и РНК, вытягивание игл, юстировка оптического оборудования и устранение проблем при микроинъекции, подробно описаны в нашем письменном протоколе.

При визуализации и анализе микроинъектированной мРНК важно, чтобы количественная оценка ограничивалась теми клетками, в которые более 90% инъекционной жидкости попало в ядро. Успешность ядерной инъекции можно оценить, визуализировав распределение органо-зеленого декстрана в ядре и цитоплазме. Дополнительную информацию о разработке зондов для рыб и использовании программного обеспечения для анализа изображений с целью анализа распределения мРНК в цитоплазме и ядре можно найти в нашем онлайн-протоколе.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.