Методы Patch Clamp Емкость записи из Чашечка

Здравствуйте, меня зовут Кен Парадизо. Я работаю под руководством Лин Ганг Ву в рамках программы внутренних исследований Национального института неврологических расстройств и инсульта, который расположен в кампусе NIH в Бетесде. Я продемонстрирую вам методы проведения пресинаптической регистрации методом пэч-кламп из чашечки.

Для подготовки ткани мозга необходимо извлечь мозг крысы. Мы помещаем мозг в этот раствор — ледяной раствор с низким содержанием кальция, который должен постоянно продуваться карбогеном для обеспечения постоянного притока кислорода к мозгу. Раствор также должен быть ледяным, чтобы свести к минимуму степень повреждения.

Таким образом, мозг теперь находится в этом растворе. Мы извлекаем его, при необходимости обрезаем для закрепления на предметном столике, фиксируем на столике с помощью Sano correlate или суперклея, после чего заполняем камеру ледяным раствором с низким содержанием кальция, аэрируем его, помещаем образец на вибратом и нарезаем срезы толщиной 180–190 мкм при частоте движения лезвия 70 Гц и скорости подачи 0,01–0,02 мм/с. Таким образом, скорость составит 10–20 мкм/с.

После каждого среза мы переносим срезы из ледяного физиологического раствора в эту камеру, содержащую стандартный раствор кальция. Это тот же раствор, который используется при записи, и он находится при физиологической температуре 37 °C. Затем мы помещаем срезы сюда для восстановления.

Он остается здесь от получаса до часа перед началом физиологических экспериментов. Итак, вот мозг, и сейчас я извлеку его из раствора. Для целей демонстрации я использую более крупный мозг.

Это образец крысы P 20. Мы перевернем его. Нас интересует ствол головного мозга.

Таким образом, эта область внизу и чашечка зафиксированы примерно в этом месте. Теперь мы отсечем остальную часть мозга, изолируем ствол мозга, а затем подготовим его для камеры для нарезки. Хорошо, теперь мы отсечем остальную часть мозга, чтобы изолировать только ствол мозга.

Я переверну его, чтобы показать текущий этап. Обычно мы так не делаем, и, повторюсь, эту часть можно просто удалить. Перевернув его обратно, мы изолировали ствол мозга, и теперь сделаем еще один разрез прямо здесь.

Хорошо, на этом всё. Это ствол мозга. Чашечки Хенле находятся примерно здесь и здесь.

Это ствол мозга. Снова немного отодвинем его назад. Мы отсечем одну сторону мозжечка, что позволит стволу мозга лежать в таком боковом положении.

Мы наносим небольшое количество акрилового клея Sano и, удерживая заготовку в горизонтальном положении, быстро заполняем её холодным льдом и холодным раствором с низким содержанием кальция. Как можно скорее вставьте линию подачи кислорода. Теперь мы поднимаем образец и переносим его к вибратору.

Мы быстро перемещаем инструмент до начала мозга, а затем, достигнув этой точки, снижаем скорость до 0,01 миллиметра в секунду. Таким образом, скорость составляет 10 мкм/с. Инструмент движется крайне медленно.

Первая часть мозга — это область, в которой находится mtb, то есть медиальные ядра трапециевидного тела. Именно эта часть содержит... Итак, как только образец оказывается в переносной пипетке, я стараюсь переместить его максимально близко к кончику пипетки. Вот срез мозга, и я довольно быстро переношу его в эту камеру, которая содержит стандартный регистрирующий раствор с нормальным уровнем кальция и более высокой температурой.

Это позволит срезам восстановиться после процедуры нарезки, чтобы они были готовы к физиологическим экспериментам. Хорошо, далее действия будут повторяться последовательно. Для проведения патч-кламппирования я буду использовать следующее оборудование.

Мы используем вертикальный микроскоп с фиксированным предметным столиком. Столик зафиксирован, поэтому микроскоп перемещается под ним с помощью манипулятора. Для удержания предметного столика мы используем микроманипулятор Wigs and Newman; в качестве головного модуля усилителя мы используем patch-clamp усилитель EPC 10 от компании HEKA.

Также мне следовало упомянуть, что мы используем дифференциально-интерференционный контраст (DIC) с инфракрасным светом. Здесь установлена ИК-камера, поэтому все, что мы видим при поиске CAE, отображается на экране. Усилитель для метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) управляется программным обеспечением Pulse, которое также произведено компанией Heka; с его помощью осуществляется управление усилителем и всем ходом физиологического эксперимента.

Результаты будут отображаться на этом экране. Чашечка, которую мы держим, представляет собой крупный пресинаптический терминал, и благодаря его большому размеру мы можем физически установить патч-зажим на терминал. Таким образом, мы можем проводить пресинаптические записи, что является довольно уникальной возможностью, особенно для ЦНС.

Таким образом, мы можем измерять активность кальциевых каналов, активируемых пресинаптически. Мы также можем измерять активность потенциалов действия, если возникнет необходимость стимулировать нерв, ведущий к каликсу. В данной лабораторной работе мы измеряем процесс, называемый экзоцитозом, который представляет собой слияние везикул, содержащих нейромедиатор, с мембраной.

Теперь эти везикулы сливаются с мембраной в процессе, называемом экзоцитозом; при этом они добавляют мембрану в синаптическую терминаль, что мы можем измерить как изменение емкости. По мере добавления мембраны в терминаль мы наблюдаем увеличение емкости, поэтому эксперименты, которые я продемонстрирую сегодня, представляют собой измерения емкости на пресинаптическом уровне, когда мембрана удаляется. Поскольку нельзя бесконечно добавлять мембрану, ее, разумеется, необходимо частично удалять.

Этот процесс называется эндоцитозом или мембранным захватом. Мы также можем измерить этот показатель, что будет выражаться в снижении уровня емкости; примеры этого мы приведем позже. Теперь эта возможность позволяет нам контролировать активность кальциевых каналов, а также отслеживать и изучать некоторые белки, участвующие в экзоцитозе и эндоцитозе.

Для блокирования белков, участвующих в экзо- или эндоцитозе, можно использовать такие вещества, как пептиды. Также можно применять токсины, которые оказывают аналогичное действие. Кроме того, мы можем регулировать количество ионов кальция, поступающих в терминаль, что позволяет детально изучать процесс экзоцитоза — высвобождение нейромедиатора, а также последующий захват мембраны.

Это пробирка с нашим раствором для внутриклеточного регистрирования. Мы подготавливаем его заранее, затем замораживаем; обычно такой раствор можно использовать в течение нескольких недель или месяца, прежде чем потребуется приготовить новый. Кроме того, непосредственно перед началом регистрирования в пробирку неизбежно попадает определенное количество частиц пыли или другого мусора.

Вы можете поступить одним из двух способов. Можно либо извлечь раствор и профильтровать его, либо центрифугировать его в течение одной-двух минут, а затем слить супернатант, оставив нижнюю часть с осадком и другими примесями. Я предпочитаю центрифугирование, и сейчас я это сделаю.

Перед нами пробирка с внутриклеточным раствором. Раствор разморожен. Мы центрифугируем его в течение двух-трех минут в мини-центрифуге; этого должно быть достаточно, чтобы удалить из раствора любые крупные частицы пыли.

Теперь я просто снимаю верхний слой раствора, который мы только что центрифугировали, стараясь не взбалтывать его, и переношу в чистую пробирку, забирая примерно 90% объема. Я снова стараюсь не захватить самый нижний слой, поэтому остановлюсь примерно на этом уровне.

Я немедленно помещаю это на лед, чтобы образец оставался холодным на протяжении всего эксперимента. Это очень важно. Вот одна из наших пипеток.

Мы используем этот инструмент для внутриклеточного регистрирования. Это силикатное стекло с толстыми стенками, внешним диаметром 2 мм и внутренним диаметром 1,16 мм. Сначала мы заполняем пипетку раствором с обратной стороны.

Затем мы создаем вакуум: погружаем пипетку в регистрирующий раствор и прикладываем всасывание, чтобы заполнить самый кончик пипетки, который иначе заполнить невозможно. После этого мы берем капиллярную трубку и заполняем остальную часть электрода, просто постукивая по задней части пипетки. Это стандартный физиологический прием, заключающийся в легком постукивании.

Существует риск сломать кончик пипетки, однако если этого не сделать, часто возникают пузырьки воздуха. Теперь мы помещаем ее в держатель для пипеток, который подключен к головной части patch-clamp усилителя. Там находится проволока из хлорида серебра.

Проволока из хлорида серебра вступает в контакт с внутриклеточным раствором, что позволяет нам измерять электрическую активность в пресинаптическом окончании. Таким образом, мы находим срез с большим количеством CAE, так как нам необходима высокая плотность CAE.

Таким образом, мы ищем медиальное ядро трапециевидного тела (MNTB) — именно там находится терминальный конец, который образует чашечку (calyx), или где обнаруживается calyx. Поэтому мы начинаем сканировать срез. Например, здесь мы видим чашечку, расположенную глубоко под поверхностью, и за нее не за что зацепиться, поэтому мы продолжаем сканирование.

Вот чашечка, которую мы будем использовать. Я сделал две метки на экране, которые указывают место, куда будет направлена пипетка. Вы видите фрагмент чашечки, к которому будет опускаться пипетка.

Я создам положительное давление, чтобы прижать чашечку, а затем сниму его. После этого чашечка прижмется к пипетке, и в этот момент я применю очень осторожное всасывание, чтобы втянуть мембрану или добиться ее плотного прилегания к кончику пипетки. Итак, положительное давление снято.

Теперь я применю вакуумное всасывание. Здесь мы подаем импульс силой 5 мВ, или, фактически, 4 мВ. Хорошо, готово.

Теперь мы снижаем мембранный потенциал до -80, чтобы устранить быстрый переходный всплеск. Сейчас мы перейдем к конфигурации «целый отдел» (whole cell). Я применю осторожное всасывание и постараюсь перейти в режим whole cell.

Эти переходные процессы при зарядке указывают на то, что пипетка и клетка теперь представляют собой единое целое, то есть установлена полноценная запись. Это еще один отличный кадр. Светло-красная линия здесь — это кривая емкости, и видно, что произошел резкий скачок, после чего она снизилась.

Итак, я только что продемонстрировал вам основные методы регистрации сигналов с пресинаптического окончания чашеобразного (каликсного) синапса. Я показал вам, как подготовить срезы, содержащие медиальное ядро трапециевидного тела — именно там расположены чашеобразные синапсы.

Я продемонстрировал вам методы просмотра срезов. Вам следует последовательно изучить каждый срез в поиске того, который содержит наибольшее количество клеток Кальби (caly), расположенных на поверхности. Затем найдите самую большую мембрану клетки Кальби из доступных и проведите регистрацию методом патч-кламп.

Также я продемонстрировал вам методы регистрации методом патч-клампа; это стандартные техники регистрации методом патч-клампа.