Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки

Здравствуйте, меня зовут Лам, я учусь в аспирантуре в Институте сердца и диабета BE IDI под руководством доктора Тома Карианне, главы Лаборатории эпигеномной медицины. В этом видео я продемонстрирую процедуру, известную как анализ клоногенного выживания. Это метод с 50-летней историей, который позволяет оценить влияние различных воздействий, таких как облучение или химические агенты, на репродуктивную жизнеспособность клеток.

Анализ выживаемости конгенных линий является основным методом в радиобиологии для оценки радиочувствительности различных клеточных линий и тестирования эффективности различных радиопротекторных или радиосенсибилизирующих соединений. При использовании адгезивной клеточной линии анализ выживаемости в условиях криоконсервации состоит из трех фаз. Первая фаза — воздействие на монослой адгезивных клеток.

Во-вторых, подготовка суспензии одиночных клеток, посев известного количества клеток в чашки и их маркировка, и в-третьих, окрашивание, подсчет и анализ колоний, образовавшихся после периода инкубации. В этом видео я буду использовать иммортализованные клетки синоцитов человека, чтобы продемонстрировать, как анализ полигенных колоний может быть использован для определения радиопротекторных свойств природного антиоксиданта. Заранее в колбы T25 высевают клетки в 5 мл среды, чтобы к дню эксперимента в каждой колбе было 1 миллион клеток.

В каждую соответствующим образом промаркированную колбу с 5 мл среды добавляют по 50 µL препарата в различных концентрациях для достижения требуемого значения; в данном случае используются пять концентраций, а также один контроль растворителя — PBS. После добавления препарата клетки инкубируют в течение одного часа в условиях, соответствующих используемой клеточной линии. После инкубации образцы, за исключением контрольной группы, облучают выбранной дозой, которая в данном случае составляет 4 Gy, генерируемой источником гамма-излучения на основе цезия.

После облучения среды сливают, и каждую колбу промывают двумя мл PBS в течение пяти минут. После слива PBS в каждую колбу добавляют два мл 0,05%трипсина для отделения адгезивных клеток A от стенок колбы. Затем в каждую колбу добавляют пять мл DMEM, содержащего 10%фетальной бычьей сыворотки, для инактивации трипсина.

Затем все содержимое флакона переносят в маркированные центрифужные пробирки типа «Falcon» объемом 10 миллилитров. По завершении пробирки центрифугируют в течение пяти минут, после чего осторожно сливают супернатант, не задевая осадок, и в каждую пробирку добавляют по пять миллилитров среды Crecy. Для каждого образца рассчитывают концентрацию клеток, а также объем каждого образца, необходимый для достижения конечной концентрации клеток при посеве в пять чашек Петри на образец, в каждую из которых добавляют по пять миллилитров среды.

Например, для контрольной группы на одну чашку высевают 100 клеток, поэтому объем, необходимый для получения 500 клеток на 25 миллилитров, рассчитывается соответствующим образом. Для более концентрированных образцов выполняют либо десятикратное разведение, либо последовательное стократное разведение, чтобы минимизировать погрешность при использовании объемов менее 100 микролитров. Затем в пробирке Falcon, содержащей 25 миллилитров среды, готовится ранее рассчитанный объем для каждого образца. Теперь образцы можно перенести в предварительно промаркированные чашки, добавляя по пять миллилитров в каждую чашку для удобства манипуляций и транспортировки.

Поместите чашки в большой стерильный или продезинфицированный контейнер. Затем чашки переносят в увлажненный инкубатор при соответствующих условиях и инкубируют в течение восьми дней. При использовании кератиноцитов по истечении восьми дней аккуратно извлеките чашки из инкубатора и разложите их по одной внутри вытяжного шкафа.

Будьте осторожны при обращении с планшетом, чтобы не повредить образовавшиеся колонии. Снимите крышки и добавьте по 5 ml 0,9% физиологического раствора в каждую чашку для промывки. Направьте кончик пипетки в угол чашки, стараясь не касаться дна, чтобы случайно не соскоблить колонии.

Через пять минут осторожно аспирируйте физраствор. Затем колонии фиксируют тремя миллилитрами 4% формулы, при этом крышки необходимо закрыть, чтобы избежать испарения. Через 15–30 минут формулу аспирируют и утилизируют соответствующим образом.

Теперь колонии готовы к окрашиванию 0,1% кристаллическим фиолетовым; в каждую чашку добавляют по пять миллилитров красителя, после чего через полчаса или час крышки возвращают на место. Затем краситель смывают дистиллированной водой, чашки переворачивают и оставляют сохнуть на ночь. Теперь колонии готовы к подсчету.

Колонии можно подсчитать вручную с помощью стереомикроскопа. Любое скопление из 50 или более клеток считается колонией. На этом наш демонстрационный показ анализа выживаемости конгенных линий завершен.

Основным преимуществом данного анализа по сравнению с другими методами является его невероятно высокая чувствительность, позволяющая определять выживаемость в широком диапазоне даже после гибели клеток на шесть порядков. Такая чувствительность достигается за счет высева большего количества клеток. Данный анализ может быть легко использован и для других целей, например, для тестирования цитотоксичности.

Спасибо за просмотр.