Бимолекулярные флуоресценции комплементации

Целью данного эксперимента является определение того, взаимодействуют ли два белка в клетках, а также изучение особенностей участков этого взаимодействия. Сначала клетки трансфецируют экспрессионными конструкциями, кодирующими два интересующих белка, один из которых слит с N-концевым фрагментом флуоресцентного белка, а другой — с комплементарным C-концевым фрагментом этого же флуоресцентного белка. После того как трансфецированные клетки в культуре развили флуоресцентный сигнал, белковые комплексы визуализируют с помощью имиджинга и иммуноблоттинга.

Затем полученные изображения экспортируются в программное обеспечение для анализа изображений, такое как Image J. Для количественного определения средней интенсивности флуоресценции на одну клетку в контролируемом эксперименте результаты BIFC могут продемонстрировать белок-белковые взаимодействия и локализацию этих комплексов, например, пересечение SH3-доменов скаффолд-белка и пролин-богатого домена PI3KC2β. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методами, такими как колокализация, иммунопреципитация и FRET, является то, что BFC позволяет пространственно локализовать более слабые транзиторные взаимодействия в клетке. Кроме того, этот метод не требует обширной постобработки изображений, что характерно для FRET.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области передачи сигнала, такие как: взаимодействуют ли белки X и Y и, если да, в каких именно компартментах клетки локализованы эти комплексы? Как правило, новички в этом методе сталкиваются с трудностями из-за неправильного выбора конфигурации для экспрессии их биосеноров. Меченые целевые белки: начните с выбора одного из нескольких флуорофоров для слитных белков BIFC.

Учитывайте, что амино- и карбоксиконцевые участки Venus способны образовывать комплекс при 37 °C, в то время как фрагменты Y-F-P-B-I-F-C требуют предварительной инкубации при 30 °C. Спроектируйте экспрессионные векторы для добавления меток к исследуемым белкам, принимая во внимание, как присоединение фрагментов BIFC может повлиять на функцию этих белков. Например, белки семейства RAs и GTP a's подвергаются липидной модификации на карбоксильном конце, поэтому их нельзя метить с этой стороны, чтобы не нарушить данную модификацию.

Всегда проводите предварительные эксперименты для определения условий трансфекции. Также контролируйте клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы определить оптимальное время для развития сигнала. Затем проведите вестерн-блот-анализ для подтверждения равной экспрессии конструктов.

Важно провести иммуноокрашивание на HA- или flag-метку, чтобы убедиться, что добавление фрагментов BIFC не изменяет клеточную локализацию исследуемых белков для каждой планшетки. Высейте 1,3 × 10⁵ клеток в каждую лунку планшета с стеклянным дном и в две лунки планшета на шесть лунок, затем оставьте клетки для осаждения на ночь в инкубаторе при 37 °C. На следующий день подготовьте ДНК для трансфекции с помощью липофекции или другого предпочтительного метода.

Сначала разведите ДНК в 250 мкл безсывороточной среды DMEM в качестве контроля трансфекции. Добавьте CFP в соотношении 1:50 к общему количеству ДНК для BIFC. Затем разведите липосомы в 250 мкл безсывороточной среды DMEM, используя 10 мкл липосом на 1 мкг ДНК.

Смешайте разведенные растворы ДНК и липидов, инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут. Дважды промойте клетки теплым DMEM без сыворотки. Добавьте по два миллилитра DMEM без сыворотки в каждую планшетную лунку с стеклянным дном или в лунку шестилуночного планшета.

Затем равномерно разделите каждую трансфекционную смесь между одной чашкой с стеклянным дном и двумя лунками планшета на шесть лунок; инкубируйте клетки при 37 °C в течение пяти часов. В завершение удалите трансфекционную среду и замените ее полной средой DMEM с добавлением 10% FBS.

Инкубируйте клетки в течение времени, определенного в ходе предварительных экспериментов, чтобы достичь необходимых уровней экспрессии интересующих белков. Осмотрите трансфицированные клетки под эпифлуоресцентным микроскопом, чтобы убедиться в наличии флуоресценции положительного контроля. Трижды промойте клетки PBS перед проведением визуализации живых клеток.

Поместите клетки в среду без индикаторных красителей. Для визуализации фиксированных клеток добавьте 2% параформальдегида и выдержите на льду в течение 10 минут.

Затем трижды промойте клетки буфером PBS, после чего добавьте 1 мл PBS и храните в темноте при температуре 4 °C; затем немедленно проведите лизис клеток в планшете на 6 лунок. Для проведения вестерн-блот анализа важно подготавливать все клетки одновременно, чтобы лизированные клетки были репрезентативны по отношению к клеткам, используемым для визуализации. Выполните вестерн-блот, чтобы убедиться, что белки с меткой экспрессированы на эквивалентных уровнях.

При получении изображений клеток с помощью конфокального микроскопа важно сохранять неизменность настроек на протяжении всего эксперимента, чтобы интенсивность флуоресценции была сопоставимой для всех образцов. Убедитесь, что изображения отдельных клеток получены без насыщения пикселей. Поскольку CFP использовался в качестве контроля трансфекции, для анализа сигналов BIFC выбирайте только CFP-положительные клетки.

Количественно определите флуоресценцию с помощью программного обеспечения для анализа изображений, такого как Image J. Откройте файлы изображений в Image J. Перейдите в Analyze > Set Measurements. В окне параметров измерений отметьте галочками поля Area (площадь) и Mean Gray Value (среднее значение серого). Обратите внимание, что в данном примере изображения вен окрашены в зеленый цвет (псевдоцвет), а изображения CFP — в красный (псевдоцвет).

С помощью инструмента «свободное выделение» (freehand selection tool) обведите контур всей клетки на канале CFP, оставив выделение на месте. Перейдите на канал YFP. В меню «анализ» (analyze) измерьте среднее значение серого цвета (mean gray value), которое отражает среднюю интенсивность флуоресценции на клетку для каждого изображения.

Очертите круг в канале YFP на участке, где нет клеток. Измерьте интенсивность сигнала в этой области для определения фона. Вычтите значение фона из каждого изображения.

Наконец, чтобы рассчитать среднюю интенсивность флуоресценции для популяции клеток, вычислите среднее значение интенсивности за вычетом фона для всех клеток, визуализированных в одном образце. В идеале следует провести количественный анализ 60 клеток в трех экспериментах. Многодоменный скаффолд-белок Intersecting регулирует выживаемость нейронов посредством регуляции нового класса PI3K класса II, PI3K-C2β; SH3-домены Intersecting взаимодействуют с аминотерминальным пролин-богатым регионом PI3K-C2β. Трансфекция VN-меченого Intersecting и VC-меченого PI3K-C2β приводит к появлению флуоресцентного сигнала в канале YFP, который окрашен в зеленый цвет (псевдоцвет), что указывает на формирование комплекса.

CFP, псевдораскрашенный здесь в красный цвет, используется в качестве контроля для маркировки трансфицированных клеток; мутации в пролин-богатом домене PI3K-C2β, которые нарушают ко-преципитацию интерина и PI3K-C2β, приводят к снижению сигнала BIFC. Это различие в сигнале BIFC не связано с различиями в экспрессии белков PI3K дикого типа и PA. После освоения эта методика может быть выполнена за три дня при правильном подходе. При выполнении данной процедуры необходимо помнить о необходимости проведения соответствующих контролей и проверки экспрессии белков, чтобы убедиться, что различия в сигнале BIFC обусловлены различиями в формировании комплекса, а не уровнем экспрессии после выполнения данной процедуры.

Другие методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс, могут быть применены для ответа на такие вопросы, как каковы различия в аффинности этих комплексов друг к другу?