Обнаружение белковых взаимодействий в завод использованием шлюза Совместимость комплементации флуоресценции Бимолекулярные (BiFC) Системные
16 сентября 2011 г.
Мы разработали методику для тестирования белок-белковых взаимодействий в растение. Желтый флуоресцентный белок (YFP) расщепляется на два непересекающихся фрагментов. Каждый фрагмент клонировали в рамке интересующего гена через шлюз системы, что позволяет выражение плавления белков. Восстановление сигнала YFP только тогда, когда следствие белки взаимодействуют.
Для проверки взаимодействия двух белков два интересующих гена должны быть клонированы в наши векторы BF с использованием метода Gateway. Полученные конструкции трансформируют в штамм Agrobacterium GV3101. Бактериальные культуры GV3101, содержащие обе конструкции, смешивают и совместно инфильтруют в листья.
Если два исследуемых белка взаимодействуют друг с другом, сигнал YFP можно наблюдать с помощью конфокальной микроскопии. Основная цель метода BFC заключается в проверке взаимодействия между двумя белками. В vavo мы создали серию совместимых с системой Gateway векторов для BFC и двухгибридных векторов ISTO, которые предоставляют исследователям удобные инструменты для проведения анализов методом BFC и двухгибридного анализа ISTO.
В данном видео мы продемонстрируем простоту использования нашей системы BFC. Для тестирования белка и белковых взаимодействий в системе экспрессии transcend. Сначала вам необходимо подготовить бактериальную культуру GV 3 1 0 1.
Необходимо выбрать одну колонию с чашки и инокулировать её в 5 мл среды YEB с соответствующими антибиотиками. Затем эти культуры следует инкубировать в течение ночи при 28 °C при перемешивании. Скорость встряхивания составляет 200 об/мин.
Бактериальные культуры должны быть готовы к следующему утру. Убедитесь, что бактерии достаточно выросли. Извлеките культуры из инкубатора и перенесите по одной петле из каждой культуры в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
Поместите центрифужные пробирки в настольную центрифугу. Центрифугируйте бактерии при 1000 G в течение 10 минут при комнатной температуре, затем удалите супернатант. После этого промойте осадок, добавив одну порцию среды для инфильтрации и аккуратно перемешав содержимое несколько раз путем легкого постукивания.
Повторите этап промывки еще два раза. Это важно, так как помогает удалить остатки антибиотиков из бактериальной среды, что предотвратит гибель клеток растений после инфильтрации. После финальной промывки повторно суспендируйте осадок в 0,5 мл среды для инфильтрации. Измерьте OD₆₀₀ этой бактериальной суспензии с помощью спектрофотометра, используя среду для инфильтрации в качестве холостой пробы.
После измерения OD необходимо скорректировать значение OD с помощью среды для инфильтрации. Конечный показатель OD должен составлять от 1 до 1,2. Перед переходом к следующему этапу следует подготовить все бактериальные суспензии.
Перенесите равные объемы бактериальных суспензий, соответствующих двум вашим белкам-кандидатам, и смешайте их в новой пробирке объемом 1,5 мл. Полученная смесь бактерий теперь готова к инфильтрации. Подготовьте все комбинации, не забудьте включить отрицательный контроль. Для инфильтрации следует использовать пяти-шестинедельные растения Nicotiana benthamiana.
Вы можете вынести растения из камеры выращивания и оставить их на ночь на один час перед инфильтрацией, чтобы устьица открылись. Это поможет процессу инфильтрации. Наберите около 100 µL бактерий, суспендированных в Resus.
Смешайте содержимое в шприце с закругленным кончиком без иглы. Приложите кончик шприца к нижней стороне листа. Поддержите верхнюю сторону колена пальцем.
Обычно следует нажать на поршень. Вы должны увидеть, как жидкость диффундирует через лист, заполняя межклеточные воздушные пространства. После инфильтрации пометьте инфильтрованный лист маркером; в противном случае через два дня вы не сможете идентифицировать инфильтрованный образец. Если вам необходимо провести инфильтрацию с разными бактериальными смесями, обязательно обработайте перчатки 50% ethanol или смените перчатки между инфильтрациями.
Старайтесь оставлять промежуток в один метр между инфильтрациями, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Сигналы PFA следует контролировать каждые 24 часа с момента инфильтрации в течение пяти дней. Для фиксации образца можно использовать два защитных чехла разных размеров.
Сначала нанесите одну каплю воды на покрытие предметного стекла. Затем с помощью скальпеля вырежьте небольшой фрагмент ткани из зоны инфильтрации. Старайтесь избегать попадания вен в образец.
Поместите срез ткани, полученный с помощью ножа, в воду на предметном стекле. Накройте его подходящим по размеру покровным стеклом и аккуратно прижмите. Теперь образец можно исследовать под микроскопом. В данном случае для визуализации сигнала BIFC используется конфокальный микроскоп NACA T CSS P two.
Можно использовать даже обычный микроскоп. Конфокальный микроскоп обеспечивает более качественные изображения и позволяет обнаруживать слабые сигналы. Для детектирования сигналов VFC в данной системе NCAs P two можно использовать параметр YFP.
Вы можете просто дважды щелкнуть по этому пресету YFP, что автоматически включит возбуждение и установит диапазон детектирования эмиссии. Если вы используете другую систему, пожалуйста, обратитесь к руководству для правильной настройки параметров. Мы надеемся, что после просмотра этого видео вы сможете проводить BFCE для проверки белок-белковых взаимодействий с использованием системы экспрессии unbe MI Transcend.
Данную процедуру также можно применять к растениям табака и AY. Наши векторы BFC также содержат теги HA и flag соответственно, поэтому при необходимости вы можете провести ко-иммунопреципитацию (co IP) для подтверждения взаимодействий.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена новая методика анализа белок-белковых взаимодействий в растениях с использованием метода разделенного желтого флуоресцентного белка (YFP). Путем клонирования фрагментов YFP в одной рамке считывания с исследуемыми генами исследователи могут наблюдать реконституцию YFP, что указывает на взаимодействие белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология растений
- Белок-белковые взаимодействия
- Методы использования флуоресцентных белков
Теоретические основы
- Понимание белковых взаимодействий имеет решающее значение для выяснения биологических процессов.
- Традиционные методы могут быть неприменимы для растительных систем.
- Метод разделенного YFP позволяет визуализировать взаимодействия в режиме реального времени.
- Клонирование Gateway облегчает конструирование гибридных белков.
Цель исследования
- Разработать эффективный метод изучения белок-белковых взаимодействий в растениях.
- Предоставить исследователям инструменты для проведения анализа бифлуоресцентного комплементации (BFC) и двухгибридного анализа ISTO.
- Углубить понимание функций белков в биологии растений.
Используемые методы
- Клонирование фрагментов YFP в Gateway-совместимые векторы.
- Трансформация конструктов в Agrobacterium GV3101.
- Ко-инфильтрация бактериальных культур в листья растений.
- Наблюдение сигнала YFP с помощью микроскопии для подтверждения взаимодействий.
Основные результаты
- Успешная реконституция сигнала YFP указывает на взаимодействие белков.
- Демонстрация эффективности метода BFC в растительных системах.
- Предоставление удобных инструментов для исследователей.
- Валидация метода с использованием различных пар белков.
Выводы
- Метод расщепленного YFP является ценным инструментом для изучения белок-белковых взаимодействий в растениях.
- Данный метод может способствовать дальнейшим исследованиям в области биологии растений.
- Будущие области применения могут включать изучение сложных белковых сетей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Анализ белок-белковых взаимодействий в растительных системах способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов в процессе разработки агрохимикатов и биопрепаратов. Система BiFC, совместимая с Gateway, позволяет проводить воспроизводимый скрининг взаимодействий in vivo с количественным определением флуоресценции, что повышает достоверность прогнозов при оценке мишеней на ранних стадиях. Данный подход снижает зависимость от непрямых методов анализа и способствует кросс-функциональному взаимодействию между группами по биологии растений и трансляционным исследованиям.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет напрямую проверять терапевтические гипотезы путем визуализации белковых взаимодействий in planta.
- Операционная ценность: предоставляет совместимую с системой Gateway платформу для быстрого клонирования и тестирования целевых пар без повторного секвенирования.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков путем подтверждения взаимодействий в клеточном контексте, близком к естественному.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: Создание стандартизированных биологических систем, подходящих для последующего скрининга соединений или модуляторов.
- Количественный выход: Интенсивность флуоресценции YFP обеспечивает измеряемый показатель силы взаимодействия и моделирования зависимости «доза-ответ».
- Масштабируемость: Совместимость с высокопроизводительными рабочими процессами агроинфильтрации в Nicotiana benthamiana.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболеваний: облегчает изучение путей воздействия мишеней растительного происхождения с потенциальными трансляционными биомаркерами.
- Механистическая преемственность: связывает результаты первичного поиска с доклинической валидацией за счет согласованных данных о взаимодействиях.
- Решения с учетом рисков: позволяет приоритизировать мишени на основе подтвержденных сетей взаимодействий.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Система BiFC встраивается в континуум ранних этапов поиска, обеспечивая проверку гипотез и разработку методов анализа до начала работ по идентификации соединений-лидеров при поиске терапевтических средств на основе растений.
- Биология открытий: способствует валидации мишеней и уточнению сигнальных путей посредством детектирования прямых взаимодействий.
- Скрининг: позволяет подготавливать воспроизводимые количественные анализы взаимодействий для кампаний по скринингу соединений.
- Аналитика: измерение сигнала YFP предоставляет количественные данные для сравнения условий взаимодействия и генетических пертурбаций.
- Трансляционные исследования: согласуется с поиском биомаркеров путем подтверждения взаимодействий в релевантных моделях растений при заболеваниях.
- Корпоративное повторное использование: совместимость с гейтвей-системами позволяет повторно использовать векторы в нескольких проектах и системах экспрессии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: снижает механистическую неопределенность, предоставляя прямые визуальные доказательства белок-белковых взаимодействий в живых клетках.
- Операционная ценность: стандартизирует тестирование взаимодействий с помощью протоколов клонирования Gateway и агроинфильтрации.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований за счет повышения уверенности в связывании с мишенью на ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе валидированных данных о взаимодействиях.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярного клонирования, агроинфильтрации и флуоресцентной микроскопии.
- Зависит от наличия инфраструктуры для агробактериальной трансформации, а также возможностей конфокальной или широкопольной микроскопии.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения согласованности при корректировке OD, соблюдении времени инфильтрации и количественном определении сигнала.
- Адаптация для других видов растений может потребовать оптимизации условий инфильтрации и подбора промотора.
- На количественное определение сигнала могут влиять автофлуоресценция или субклеточная локализация, что требует использования соответствующих контролей.
